一、概述

1.1 实验目的与适用范围

本手册旨在规范慢病毒（Lentivirus, LV）包装、收获、浓缩、纯化、滴度测定及靶细胞感染的标准操作流程（SOP），保障批次间病毒质量稳定及临床前研究的可重复性。

主要应用场景：

难转染细胞（如原代细胞、干细胞、悬浮淋巴细胞）的基因递送。

稳定表达 / 敲除细胞系（Overexpression / Knockdown / Knockout）的构建。

CAR-T / TCR-T 等免疫细胞治疗载体制备。

CRISPR/Cas9 系统及 gRNA 图谱筛查。

动物体内（In Vivo）局部或系统性基因功能验证。

适用体系：基于 HIV-1 来源的第二代（三质粒）及第三代（四质粒）多质粒慢病毒包装系统。

1.2 实验原理

慢病毒属于反转录病毒科（Retroviridae），具有双链 RNA 基因组。包装系统通过将病毒结构基因、复制相关基因与目的基因拆分存在于不同的质粒中，实现“复制缺陷型”慢病毒颗粒的生产。

VSV-G 包膜特征：采用水泡性口炎病毒 G 糖蛋白（VSV-G）替换原 HIV-1 包膜蛋白，增强了病毒颗粒的稳定性（耐受超速离心），并使其具备广嗜性（Broad Tropism），能够高效感染分裂期与非分裂期细胞。

包装核心机制：

转移质粒：包含 5′ 与 3′ 顺式作用元件（LTR）、包装信号（Ψ）、启动子及目的基因（GOI）。

包装质粒：提供病毒结构蛋白 Gag/Pol 以及调节蛋白 Rev。

包膜质粒：提供外壳糖蛋白 VSV-G。

生产过程：共转染包装细胞（293T/293FT）后，细胞转录含 Ψ 信号的 GOI-RNA 并表达结构蛋白，在细胞膜下方组装，以出芽形式释放至培养上清中。

二、溶液和试剂

2.1 试剂准备

下表列出开展慢病毒包装实验所需的主要试剂及其关键规格与储存要点：

主要试剂准备

2.2 耗材与仪器

耗材与仪器推荐

2.3 试剂配制与储存

1. 质粒大提与无内毒素纯化

采用 Endo-Free Plasmid Maxi Kit 进行提取。

纯度判定：A260/A280 为 1.80–1.95；A260/A230>2.0。质粒浓度宜调制为 1.0 µg/µL，用 TE 缓冲液或无菌双蒸水溶解，-20 ℃ 分装保存。

2. 完全培养基 (Complete Medium) 配制

293T 维持培养基：DMEM 高糖 + 10% 优质 FBS + 1% Penicillin-Streptomycin (P/S)。

转染/收获培养基：DMEM 高糖 + 2%–5% 灭活 FBS（或 10% FBS）+ 1 mM 丙酮酸钠（不加抗生素，抗生素会降低转染效率并增加细胞毒性）。

3. Polybrene 母液 (10 mg/mL) 配制

称取 100 mg Polybrene 溶于 10 mL 灭活无菌 PBS 中，用 0.22 µm 滤膜过滤。分装为 500 µL/管，-20 ℃ 保存，避免反复冻融超过 3 次。

（重要生物安全与操作警示）

生物安全管控：慢病毒出芽后具人感染能力，全过程必须在 BSL-2 / BSL-2+ 实验室的二级生物安全柜中进行，穿戴双层手套、隔离衣与防护面罩。

过滤孔径限制：澄清病毒液时仅允许使用 0.45 µm 滤膜。0.22 µm 孔径滤膜会截留并破坏慢病毒颗粒（慢病毒直径通常在 80–120 nm，但常带细胞膜囊泡及聚集体）。

废弃物处置：所有接触病毒的枪头、培养皿及离心上清，须在 10% 漂白水（次氯酸钠）中浸泡至少 30 分钟，或经过 121 ℃ 高压灭菌 30 分钟后方可丢弃。

三、实验步骤

3.1 包装细胞准备

慢病毒包装的成败 70% 取决于 293T 细胞的状态。必须保证细胞处于低代数、无污染、指数生长期的状态。

代数要求：复苏后传代 2–5 代内（总代数 <20 代）。

细胞接种：转染前 18–24 h 进行铺板，确保转染时刻细胞汇合度达到 70%–80%，且单细胞分布均匀，无明显成堆聚团现象。

铺板规格与转染参考

关键控制点：

消化细胞时控制胰酶作用时间（<2 min），终止消化后轻轻吹打，避免产生气泡。

铺板后须将培养皿在桌面进行“8”字形平摇，切忌旋转晃动以防细胞集中在皿中央。

3.2 质粒转染

本手册以经典的第二代三质粒包装体系及 PEI 转染法为标准例程（100 mm 培养皿）。

1. 质粒配比表（以 100 mm 皿为例，总 DNA = 12 µg）

质粒配比（100 mm 皿，总 DNA = 12 µg）

（注：三代系统四质粒推荐比例 Transfer : pMDLg/pRRE : pRSV-Rev : pMD2.G = 4 : 2 : 1 : 1.5）

2. 转染操作步骤

无血清复合物准备：

管 A：取无菌 1.5 mL EP 管，加入 500 µL 纯 Opti-MEM（或无血清 DMEM），加入上述比例混匀的 12 µg 质粒，轻弹混匀。

管 B：取无菌 1.5 mL EP 管，加入 500 µL 纯 Opti-MEM，加入 36 µL PEI（1 mg/mL，即 DNA:PEI=1:3 质量体积比），轻弹混匀，室温静置 5 min。

复合物形成：

将管 B 的 PEI 稀释液逐滴加入管 A 中，边加边轻柔吹混或漩涡振荡。

室温（20–25 ℃）孵育 15–20 min，使其形成稳定的 DNA-PEI 纳米复合物。

加样转染：

将 1.0 mL 复合物逐滴均匀滴加至事先准备好的 293T 培养皿中。

前后左右轻摇培养皿混匀，放入 37 ℃、5% CO₂ 培养箱中培养。

培养基更换（换液）：

转染后 6–8 h，倒置显微镜下观察细胞无严重脱落，吸除含转染复合物的培养基。

轻轻加入 10 mL 预热的慢病毒收获培养基（DMEM + 2%–5% FBS，无抗生素）。

3.3 病毒收获

慢病毒通常在转染后 48–72 小时内大量释放在细胞上清中。

Harvest 流程与时间节点

收集与澄清步骤：

吸取培养上清置于 50 mL 无菌离心管中。

低速离心沉降碎片：3,000×g，4 ℃ 离心 10 min，去除悬浮的 293T 细胞死碎片。

关键过滤：取无菌注射器抽取离心上清，连接 0.45 µm PES 针头式滤器，将病毒液滤入新的无菌管中。

若不立即浓缩，粗病毒液置于 4 ℃ 可保存不超过 48 h；长期保存须冻存在 -80 ℃。

3.4 滴度测定与质控

1. 滴度测定方法对比

滴度测定方法对比

2. 流式细胞术测定功能滴度（以 GFP 为例的标准流程）

靶细胞准备：在 24 孔板中接种 293T 细胞（5×10⁴ cells/孔）。

梯度稀释感染：取 6 个 EP 管，加入无血清培养基进行 10 倍连续梯度稀释慢病毒原液（10⁻¹ 至 10⁻⁶）。

每孔加入稀释后的病毒液及 6 µg/mL Polybrene，培养 24 h 后换液。

流式检测：感染 48–72 h 后，消化细胞并用 PBS 重悬，流式细胞仪检测 GFP 阳性细胞百分比。

滴度计算公式：Titer (TU/mL) = 接种细胞数 × 荧光阳性率 (%) × 稀释倍数 ÷ 加入的病毒体积 (mL)

（注：计算时应选择阳性率在 1%–20% 之间的梯度孔，以确保单细胞多重感染率低，数据真实）

3. 质量控制标准 (QC Criteria)

质量控制标准

3.5病毒保存与使用

1. 保存规范

分装：澄清或浓缩后的病毒液必须按单次实验用量分装（如 10 µL/20 µL/50 µL 每管），严禁反复冻融。

温度：-80 ℃ 可稳定保存 12–24 个月。

每反复冻融 1 次，病毒滴度下降约 10%–20%。

4 ℃ 最长不可超过 48 小时。

2. 靶细胞感染操作流程

MOI (Multiplicity of Infection, 感染复数) 确认：MOI = 慢病毒颗粒数 (TU) ÷ 细胞数。

预实验：针对未感染过的细胞，须设定 MOI 梯度（如 1, 5, 10, 20, 50, 100）测试最佳感染效率与细胞毒性平衡点。

感染过程：

靶细胞铺板，待密度达到 40%–60% 时感染。

吸除旧培养基，更换为含 4–8 µg/mL Polybrene 的新鲜培养基。

按计算好的 MOI 加入对应体积的慢病毒液，轻轻晃匀。

（可选）平板离心助感染 (Spinoculation)：将培养板置于平板离心机，800×g，32 ℃ 离心 60–90 min，可显著提高难转染细胞（如 T 细胞、干细胞）的感染率。

换液与维持：感染 12–24 h 后，吸除含病毒及 Polybrene 的培养基，换为普通完全培养基。感染 48–72 h 后观察靶基因表达。

3. 稳定细胞系筛选 (Puromycin Selection)

感染 48 h 后，加入含有预先滴定好“致死浓度”的抗生素（如 Puromycin 1–5 µg/mL）。

维持筛选 3–7 天，期间每 2 天换液一次，直至未感染对照组细胞全部死亡。换为低浓度抗生素维持培养或扩增。

四、常见问题与注意事项

4.1 常见问题排查 (Troubleshooting)

慢病毒包装常见问题排查