一、概述
1.1 实验原理
CCK-8 试剂的核心成分为 WST-8 [2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2H-四唑单钠盐]，并在电子耦合试剂 1-Methoxy PMS 的存在下发挥作用。
显色机制：细胞活体内线粒体和胞质中的脱氢酶（如琥珀酸脱氢酶、NAD(P)H 脱氢酶）在电子载体作用下，将外源性 WST-8 还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物（Formazan）。
定量依据：生成的甲臜产物数量与活细胞数量及细胞代谢活性成正比。通过酶标仪测定在 450 nm 波长处的吸光度（OD 值），可间接反应活细胞数量。
与传统检测法（MTT / XTT / MTS）对比：
检测方法对比
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检测方法 |
显色产物 |
溶解性 |
是否需要有机溶剂（如 DMSO） |
细胞毒性 |
试剂稳定性 |
检测灵敏度 |
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MTT |
不溶性紫色结晶 |
是（需加 DMSO 裂解细胞） |
大，终点法 |
一般，需现配 |
较低 |
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XTT / MTS |
水溶性橙色甲臜 |
否 |
较小 |
差，配制后易失效 |
中等 |
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CCK-8 (WST-8) |
极佳水溶性 |
否（直接加样测定） |
无毒，细胞可继续培养 |
高（4 ℃ 可保存数月） |
最高 |
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1.2实验体系定位
CCK-8 主要检测细胞的总体代谢活性（Metabolic Activity）。需要注意的是，当细胞处于特定应激状态时（如早期凋亡或某些线粒体激活剂作用下），代谢活性的改变可能与细胞绝对数量不完全一致。因此，在高水平科研或药物研发中，建议将 CCK-8 实验与以下实验联合互证：
EdU 插入法 / DNA 合成测定：确证细胞进入 S 期的增殖状态。
克隆形成实验（Colony Formation）：评估单细胞长时期的自我更新与增殖能力。
Annexin V / PI 双染流式检测：确证药物引起的细胞毒性是否属于细胞凋亡或坏死。
二、溶液和试剂
2.1 试剂准备
下表列出开展 CCK-8 实验所需的主要试剂及其关键规格与存储要点：
试剂准备、储存条件与适用场景
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试剂名称 |
配置 / 准备要点 |
推荐储存条件 |
适用场景与注意事项 |
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CCK-8 试剂盒（丰度蛋白 Cat# ABD-CCK8） |
纯原液，直接使用；使用前室温解冻，轻弹混匀 |
-20 ℃ 长期保存（避光）；4 ℃ 储存 2 个月 |
按培养液体积 1/10 添加；全程避光操作 |
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完全培养基 |
基础培养基（如 DMEM/RPMI-1640）+ 10% FBS + 1% 双抗 |
4 ℃ 避光保存 |
建议使用同一批次血清，避免血清本底波动 |
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1× PBS 缓冲液 |
无菌，pH 7.2–7.4 |
4 ℃ 保存 |
用于细胞洗涤及边缘孔蒸发封闭 |
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0.25% 胰酶-EDTA |
0.25% Trypsin with 0.02% EDTA |
-20 ℃ 保存 |
消化贴壁细胞；消化时间过长会损伤细胞膜 |
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0.4% 台盼蓝染液 |
0.4% Trypan Blue solution |
室温保存 |
铺板前细胞活率计数，确保活率 >90% |
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干预药物 / 化合物 |
用 DMSO 或 PBS 溶解配制高浓度母液，用无血清/完全培养基稀释 |
-80 ℃ / -20 ℃ 保存 |
含还原性成分（如 VitC、GSH）需特殊处理 |
2.2 耗材与仪器
耗材与仪器推荐
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耗材 / 仪器名称 |
推荐规格与要求 |
关键应用与目的 |
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96 孔细胞培养板 |
透明平底、光学级透明、TC 处理 |
细胞铺板与比色，避免底部划痕 |
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多道移液器 |
8 孔或 12 孔多道移液器（20–200 µL） |
快速加样，减小孔间加样时间差导致的误差 |
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酶标仪 |
支持波长 450 nm，带参考波长（600–650 nm） |
测定光吸收度，导出数据 |
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CO₂ 恒温培养箱 |
37 ℃、5% CO₂、饱和湿度 |
细胞培养与 CCK-8 反应孵育 |
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避光加样盒 / 铝箔纸 |
遮光性能良好 |
保护 CCK-8 试剂及显色体系免受光降解 |
2.3 试剂配制与储存
CCK-8 分装：收到试剂后，建议在无菌超净台内按 1 mL/管或 5 mL/管避光分装，避免反复冻融（冻融次数超过 5 次会导致 WST-8 降解，导致背景色加深）。
PBS 配制：使用无菌双蒸水溶解或直接使用 1× 无菌现成液，开封后注意无菌操作。
警示（注）：
全程避光：WST-8 见光易自发还原。从取出试剂至酶标仪读数，需采取避光措施（使用遮光盒或铝箔纸包裹）。
还原性药物干扰：若待测药物中含有维生素 C、二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇、还原型谷胱甘肽（GSH）等还原性物质，它们会与 CCK-8 直接反应导致非细胞依赖性的显色，产生假阳性。处理方法：在加入 CCK-8 前，吸弃含药培养基，用 PBS 轻轻洗涤细胞 1–2 次后，更换为 100 µL 新鲜完全培养基再加入 CCK-8。
三、实验步骤
3.1 细胞培养与铺板
细胞准备：取处于对数生长期的细胞，消化后用完全培养基重悬为单细胞悬液。
活率检测：取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混匀，使用细胞计数板或自动计数仪计数，细胞活率必须 >90% 方可进行后续实验。
密度调整与铺板：根据细胞生长速度，用完全培养基调整至目标密度，使用多道移液器向 96 孔板每孔加入 100 µL 细胞悬液。
铺板密度参考
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细胞类型 |
细胞生长特性 |
建议铺板密度（cells/孔） |
培养体积 |
铺板后预培养时间 |
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贴壁细胞（快速增殖） |
如 HCT116, HeLa, A549 |
2,000–4,000 |
100 µL |
12–24 h（过夜贴壁） |
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贴壁细胞（慢速增殖） |
如 MCF-7, 原代细胞 |
5,000–8,000 |
100 µL |
12–24 h（过夜贴壁） |
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悬浮细胞 |
如 Jurkat, K562 |
8,000–20,000 |
100 µL |
1–2 h（适应环境） |
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细胞毒性 / IC50 测定 |
处理时间 24–48 h |
5,000–8,000 |
100 µL |
12–24 h |
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增殖曲线（连续 5 天） |
长期观察 |
1,000–2,000 |
100 µL |
12–24 h |
关键控制点：
边缘效应控制：96 孔板最外围的一圈（36 孔）不用于细胞样品检测，每孔加入 200 µL 无菌 PBS，防止因边缘培养基蒸发导致数据偏高。
对照组设置（每组设立 ≥3 个平行复孔）：
空白组（Blank）：仅含培养基 + CCK-8，无细胞。用于扣除培养基及试剂本底。
对照组（Control）：含细胞 + 培养基（含溶剂）+ CCK-8，不加药物。作为 100% 活力基准。
实验组（Experimental）：含细胞 + 培养基（含处理因素/药物）+ CCK-8。
3.2 药物处理与实验干预
贴壁细胞培养 12–24 h 恢复生长并贴壁后，吸弃原培养基（若为悬浮细胞，可直接加入高浓度药物或离心换液）。
加入用完全培养基配制的梯度浓度药物（如 0, 0.1, 1, 10, 100 µM），每孔体积 100 µL。
将培养板置于 CO₂ 培养箱中孵育预定时间（通常为 24 h、48 h 或 72 h）。
注：
时间×剂量双维度设计：探究未知化合物时，建议设计 24 h、48 h、72 h 三个时间点，配合 6–8 个梯度浓度，可同时获得增殖曲线与剂量-效应曲线。
溶剂对照：若药物母液溶剂为 DMSO，需确保终体系中 DMSO 浓度 <0.1%（最高不超过 0.5%），并在对照组中加入相同浓度的 DMSO。
3.3 加入 CCK-8 试剂
取出 CCK-8 试剂，室温避光解冻，轻弹混匀。
在避光条件下，使用多道移液器按培养液体积 1/10 的比例加入 CCK-8（即 100 µL 体系中加入 10 µL CCK-8）。加样时可将吸头贴壁滴加，避免直接吹打细胞。
CCK-8 加样量参考
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96 孔板当前培养体积（µL） |
CCK-8 试剂加入量（µL） |
最终反应总体积（µL） |
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50 |
5 |
55 |
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100（标准体积） |
10 |
110 |
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200 |
20 |
220 |
轻拍培养板侧壁或置于微孔板振荡器上微振 5 秒混匀。
防气泡技巧：加样时采用“反向吸液法”，若孔内产生气泡，可使用无菌针头刺破或移液枪吸除。气泡会导致垂直光路折射，严重干扰读取的 OD 值。
3.4 避光孵育
将加有 CCK-8 的培养板放回 37 ℃、5% CO₂ 培养箱中避光孵育 1–4 小时。
动态观察：由于不同细胞脱氢酶活性差异较大，建议在孵育 0.5 h、1 h、2 h 时观察培养基颜色变化。
孵育时间参考
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细胞代谢活性/密度 |
建议孵育时间 |
终止 / 读数标准 |
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高代谢 / 密度过大 |
0.5–1 h |
对照组孔颜色明显转为亮橙黄色 |
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常规检测（标准） |
1–2 h |
对照组 OD450 达到 1.0–1.5 |
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低代谢 / 原代细胞 / 慢速细胞 |
3–4 h |
对照组 OD450 达到 0.8–1.2 |
3.5 读取吸光度
波长设置：启动酶标仪，设置检测主波长 450 nm。若具备双波长检测能力，设置参考波长 650 nm（或 600–650 nm 任意波长）。双波长检测公式为：
ΔOD = OD450 − OD650，可自动消除细胞碎片、沉淀和板底划痕的干扰。
读数时间限制：显色终止后，务必在 1 小时内完成测定。若时间过长，甲臜产物可能过度积聚或颜色发生漂移。
3.6 数据分析与结果解读
(1) 计算公式：细胞活力与细胞抑制率的计算方法如下：
细胞活力 (%) =（OD实验组 − OD空白组）/（OD对照组 − OD空白组）× 100%
细胞抑制率 (%) = 100% − 细胞活力 (%) =（OD对照组 − OD实验组）/（OD对照组 − OD空白组）× 100%
(2) IC50 拟合与绘图：使用专业统计软件（如 GraphPad Prism）进行数据分析：
输入药物浓度的对数值 log₁₀(Concentration) 作为 X 轴，细胞活力（%）作为 Y 轴。
选择非线性回归模型：Nonlinear Regression → Dose-response - Inhibition → log(inhibitor) vs. normalized response -- Variable slope（四参数逻辑拟合 4PL）。
软件将自动计算得到 IC50（Half maximal inhibitory concentration）及其 95% 置信区间。
结果判定参考
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检测指标 |
数据形态 / 特征 |
科学结论与解释 |
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增殖促进 |
活力 >100%（p<0.05） |
提示干预因素具有促细胞生长作用或低浓度应激代偿效应 |
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毒性抑制 (IC50) |
活力降低，呈现剂量依赖性 S 型曲线 |
IC50 值越小，说明化合物对该细胞的细胞毒性/杀伤力越强 |
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数据可靠性标准 |
空白组 OD450<0.15；对照组 OD450∈[1.0,2.0]；平行复孔变异系数 CV<10% |
实验体系稳定，数据真实可靠，可用于发表或报告 |
四、常见问题与注意事项
4.1 常见问题排查
CCK-8 实验常见问题排查
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异常现象 |
可能原因分析 |
推荐解决措施 |
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1. 空白孔 OD 值偏高（OD>0.2） |
试剂被细菌或真菌污染；CCK-8 试剂见光分解；培养基本身成分（如酚红）背景高；培养基中含有还原性物质 |
换用新鲜无菌培养基；严格避光保存和加样；使用无酚红培养基进行比色；加 CCK-8 前洗涤细胞换液 |
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2. 吸光度值饱和（OD>2.5） |
铺板细胞密度过大；CCK-8 孵育时间过长；酶标仪检测波长设定错误 |
降低铺板细胞密度；缩短 CCK-8 孵育时间至 0.5–1 h；确认主波长为 450 nm |
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3. 组内复孔差异大（CV>10%） |
铺板时细胞悬液未混匀；边缘效应导致水分蒸发；加样不准确或孔内存在气泡；细胞在孔板中分布不均（贴壁不齐） |
铺板过程中保持间隔吹打悬液；外围孔加 PBS，禁止蒸发；读数前用针头消除气泡；铺板后静置 15 分钟再放入培养箱 |
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4. 加药后 OD 值不降反升（假阳性） |
药物具有还原性，直接还原了 WST-8；药物本身在 450 nm 有吸收峰（如某些天然产物/色素） |
设置无细胞 + 药物 + CCK-8 的背景孔扣除吸光度；检测前用 PBS 洗涤细胞 1–2 次后更换新鲜培养基 |
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5. 对照组 OD 值过低（OD<0.5） |
细胞状态差，活率低；铺板细胞数太少；孵育时间不足 |
重新复苏细胞，确保铺板前活率 >90%；适当增加细胞铺板数量；延长孵育时间至 3–4 h |
4.2 关键注意事项总结
严格避光：从试剂取出、滴加至孵育的全过程均应避光操作。
合理设置对照：实验必须包含“空白组”“溶剂对照组”和“实验组”。
复孔均一性：加样时推荐使用多道移液器，并定期校准移液器量程，确保每孔体积一致。
孵育时间灵活掌握：孵育时间切勿固定死板，应根据 OD450 显色情况确定最佳读数时间（推荐对照组 OD≈1.0−1.5）。
多方法互证：对于重大的关键结论，切忌单一依赖 CCK-8，建议结合流式细胞术、EdU 标记或克隆形成实验进行交叉验证。
试剂妥善保存：CCK-8 短期使用置于 4 ℃ 避光；长期不用必须置于 -20 ℃ 避光保存。
