一、概述
1.1 实验目的与适用范围
本手册旨在规范双荧光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Reporter Assay, DLR）的标准操作流程，确保基因转录调控分析及转录后调控研究的数据准确性、重复性与高信噪比。
主要应用场景：
启动子/增强子活性分析：评估核心启动子区域、顺式作用元件（Cis-elements）及增强子的转录驱动能力。
miRNA 与 3′UTR 靶向验证：验证 microRNA 与靶基因 3′非翻译区（3′UTR）的直接结合及转录后抑制作用。
转录因子（TF）活性与结合位点鉴定：分析特定转录因子对靶启动子的激活或抑制作用（结合点阵突变验证）。
细胞信号通路激活度检测：使用带有特定响应元件（如 NF-κB-RE、TCF/LEF、STAT3-RE 等）的报告质粒评估信号通路的激活状态。
小分子药物/天然产物筛选：高通量评估药物对特定转录通路或靶基因表达的调控影响。
适用细胞体系：哺乳动物贴壁细胞、悬浮细胞（如 Jurkat、K562）及难以转染的原代细胞。
1.2 实验原理
双荧光素酶报告基因系统在一个检测体系中同步表达并检测两种催化底物不同的荧光素酶蛋白：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）与海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）。
1. 显色反应分子机制
萤火虫荧光素酶 (Firefly Luciferase)：来源于 Photinus pyralis，分子量约 61 kDa。在 Mg²⁺ 和 ATP 存在下，催化底物 D-荧光素 (D-luciferin) 发生氧化脱羧反应，产生波长约为 560 nm 的黄绿色荧光。
反应式：ATP + D-Luciferin + O₂ → Oxyluciferin + AMP + PPi + CO₂ + Light (~560 nm)（Firefly Luciferase, Mg²⁺ 催化）
海肾荧光素酶 (Renilla Luciferase)：来源于 Renilla reniformis，分子量约 36 kDa。仅需溶解氧存在，催化底物腔肠素 (Coelenterazine / Stop & Glo® Substrate) 发生氧化反应，产生波长约为 480 nm 的蓝色荧光。
反应式：Coelenterazine + O₂ → Coelenteramide + CO₂ + Light (~480 nm)（Renilla Luciferase 催化）
2. 定量依据与归一化（Normalization）
消除干扰：由于细胞接种密度差异、转染效率波动、裂解效率不均以及细胞边缘效应均会导致单一报告基因发光强度出现剧烈偏差。
内参归一化：通过共转染由强/中等组成型启动子（如 SV40、HSV-TK、CMV）驱动的海肾荧光素酶质粒作为内部对照（Internal Control）。最终计算相对荧光素酶活性（Relative Luciferase Activity, RLU）：
相对荧光素酶活性 (RLU Ratio) = Firefly 发光读数 (RLUFirefly) ÷ Renilla 发光读数 (RLURenilla)
3. 与传统单报告系统的对比
单荧光素酶系统与双荧光素酶系统对比
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评价维度 |
单荧光素酶系统 (Single-Luciferase) |
双荧光素酶系统 (Dual-Luciferase) |
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实验内参 |
无（或需额外测定蛋白浓度/β-gal） |
内置海肾荧光素酶（同孔同裂解液检测） |
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转染效率校正 |
无法校正，数据变异系数 (CV) 大 (>30%) |
自动精确校正，数据变异系数小 (<10%) |
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检测流程 |
需多步骤拆分操作，耗时 |
单孔连续加样检测（先读 Firefly，后淬灭并读 Renilla） |
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信噪比 |
容易受细胞活性及铺板差异影响 |
信噪比极高，动态范围达 10⁵–10⁷ |
二、溶液和试剂
2.1 试剂准备
下表列出开展双荧光素酶报告基因实验所需的主要试剂及其关键规格与储存要点：
主要试剂准备
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试剂名称 |
配置要点 / 规格 |
储存条件 |
适用场景与注意事项 |
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萤火虫报告质粒 (Reporter Plasmid) |
如 pGL3-Basic/Enhancer、pGL4.10、pmirGLO |
-20 ℃ 保存 |
插入目的启动子或 3′UTR 序列；去内毒素大提 |
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海肾内参质粒 (Control Plasmid) |
pRL-TK 或 pRL-SV40 |
-20 ℃ 保存 |
pRL-TK 启动子强度适中，最为推荐；CMV 过强易造成转录因子竞争 |
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转染试剂 |
Lipofectamine 3000 / Lipo2000 / PEI |
4 ℃ 保存 (严禁冻结) |
按照不同细胞类型优化 DNA:转染试剂比例 |
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被动细胞裂解液 (1× PLB) |
5× Passive Lysis Buffer 稀释 |
4 ℃ / -20 ℃ 保存 |
需加无菌水稀释至 1×，彻底裂解细胞且保护酶活性 |
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萤火虫荧光素酶检测底物 (LAR II) |
Luciferase Assay Reagent II |
-80 ℃ / -20 ℃ 避光 |
包含 D-Luciferin 及反应缓冲液；严禁反复冻融 |
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海肾淬灭及检测底物 (Stop & Glo®) |
Stop & Glo® Buffer + 50× Substrate |
-80 ℃ / -20 ℃ 避光 |
淬灭 Firefly 信号并催化 Renilla 发光；现配现用 |
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Opti-MEM 稀释液 |
减血清培养基 |
4 ℃ 保存 |
用于转染复合物稀释 |
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无菌 PBS (pH 7.4) |
0.01 M 无钙镁离子 |
室温 / 4 ℃ |
裂解前洗涤细胞，去除培养基成分残留 |
2.2 耗材与仪器
耗材与仪器推荐
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耗材 / 仪器名称 |
规格要求 |
关键应用 |
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多功能酶标仪 (Luminometer) |
具备化学发光（Luminescence）检测模块，带双自动进样器（Optional） |
测量 RLU 读数，动态范围 >10⁶ |
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96 孔酶标板 (不透明白色) |
全不透明白色 96 孔平底板 (White Opaque Plate) |
发光检测专用。反射光线、最大化信号并防止孔间发光串扰 (Crosstalk) |
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透明 96 孔培养板 |
标准细胞培养级别 |
细胞转染及早期培养用（若采用原位裂解可直接接种于白色透明底板） |
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多道移液器 (Multichannel) |
8 孔或 12 孔 (20 µL–200 µL) |
快速加样，保证孔间反应时间一致 |
2.3 试剂配制与储存
1. 1× Passive Lysis Buffer (PLB) 裂解液配制
取 1 体积的 5× PLB 母液，加入 4 体积的无菌去离子水或无菌双蒸水，充分混匀。配制好的 1× PLB 可在 4 ℃ 保存 1 个月。
2. LAR II (Firefly 发光底物) 分装与解冻
将冻存的 LAR II 在室温水浴或冷水中解冻，避免局部过热。彻底混匀后，按单次实验用量（如 5 mL/管，供约 50 孔使用）进行分装，避光冻存于 -80 ℃（可保存 1 年）或 -20 ℃（保存 1 个月）。反复冻融不得超过 3 次。
3. Stop & Glo® (Renilla 发光与淬灭底物) 现配现用
注意：Stop & Glo® 50× 底物与 Stop & Glo® Buffer 必须在检测当天临用前配制。
配制比例：吸取 1 体积的 50× Stop & Glo® Substrate 溶液，加入到 49 体积的 Stop & Glo® Buffer 中，颠倒混匀。
避光保护：用铝箔纸包裹管身，室温避光保存，限 8 小时内使用完毕。
（重要实验与生物安全警示）
严禁使用黑色或透明检测板：发光检测必须使用全不透明白色板。透明板会导致光线向四周散射（Crosstalk 超过 30%）；黑色板会吸收绝大部分发光，使信号衰减 80% 以上。
底物避光与温度平衡：LAR II 和 Stop & Glo® 在检测前必须平衡至室温（20–25 ℃）。若试剂过冷，发光酶催化效率将大幅下降。
Stop & Glo® 淬灭彻底性：Stop & Glo® 具有双重功能：第一是极强地淬灭 Firefly 信号（淬灭率 >99.99%），第二是激活 Renilla 信号。如果配制不匀或浓度不足，会导致 Firefly 信号残余，造成 Renilla 读数严重偏高。
三、实验步骤
3.1 质粒准备与实验设计
1. 质粒构建与克隆方案
miRNA 3′UTR 验证：
WT 组 (Wild-Type)：将靶基因 3′UTR 全长或包含结合位点的片段（约 500–1000 bp）克隆至报告基因（如 Firefly）下游。
MUT 组 (Mutant)：将 3′UTR 上与 miRNA 种子序列（Seed Sequence, 第 2–8 位碱基）互补结合的 4–7 个碱基进行突变（如 A↔T, C↔G 颠换）。
启动子活性分析：
构建核心启动子缺失突变体截短体（Truncation Mutants）或结合位点定点突变体。
2. 实验分组设置矩阵
实验分组设计
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组别编号 |
报告质粒 (100 ng/孔) |
内参质粒 (5 ng/孔) |
处理因子 (50 nM) |
实验目的 |
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Group 1 (NC 对照) |
WT 载体 (如 pGL3-Target-WT) |
pRL-TK |
NC mimic / Empty Vector |
建立基础共表达基线 |
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Group 2 (实验组) |
WT 载体 (如 pGL3-Target-WT) |
pRL-TK |
miRNA mimic / 目的转录因子 |
评估处理因子对 WT 的调控 |
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Group 3 (突变对照) |
MUT 载体 (如 pGL3-Target-MUT) |
pRL-TK |
miRNA mimic / 目的转录因子 |
验证调控依赖于特定序列 |
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Group 4 (空白裂解底物) |
无质粒（仅细胞裂解液） |
无 |
无 |
扣除仪器与试剂背景光 |
3.2 细胞铺板与培养
铺板原则：选用指数生长期的细胞，铺板密度需保证在转染时达到 70%–80% 汇合度。
铺板密度与裂解体积参考
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培养板规格 |
单孔贴壁细胞接种量 |
培养基体积 |
1× PLB 裂解液加量 |
测定吸取上清体积 |
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96 孔板 |
1.0–2.0×10⁴ cells |
100 µL |
20–50 µL |
10–20 µL |
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24 孔板 |
0.8–1.5×10⁵ cells |
500 µL |
100–150 µL |
20 µL |
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12 孔板 |
2.0–3.0×10⁵ cells |
1.0 mL |
200–250 µL |
20 µL |
3.3 质粒共转染
内参质粒与报告质粒的比例是实验成败的关键。内参信号过强会产生启动子竞争（Promoter Competition/Squelching），过弱则归一化背景噪音大。
推荐比例：
使用 pRL-TK（较弱启动子）：报告质粒 : 内参质粒 = 10 : 1 至 20 : 1。
使用 pRL-SV40 / pRL-CMV（强启动子）：报告质粒 : 内参质粒 = 30 : 1 至 50 : 1。
使用 pmirGLO（单质粒双系统）：已按物理 1:1 构建于同一载体，无需混合。
96 孔板单孔共转染体系（以 Lipofectamine 3000 为例）
准备质粒-Lipid 复合物：
稀释液 A：Opti-MEM 25 µL + Lipofectamine 3000 0.3 µL。
稀释液 B：Opti-MEM 25 µL + 报告质粒 100 ng + pRL-TK 5 ng + (miRNA mimic 50 nM) + P3000 0.2 µL。
混合与孵育：将稀释液 A 与稀释液 B 混合，轻弹混匀，室温孵育 15 分钟。
加样：将 50 µL 复合物加入含有 100 µL 完全培养基的 96 孔中。
换液：孵育 4–6 小时后，更换为新鲜完全培养基。
3.4 实验处理
药物处理/诱导：若研究小分子药物或细胞因子（如 TNF-α, TGF-β）对通路的激活，转染 24 小时后加入药物处理 6–24 小时。
收集时间点：通常在转染后 24–48 小时细胞状态最佳时进行裂解与检测。
3.5 细胞裂解
弃培养基：从培养箱中取出 96 孔板，小心吸除或倒掉培养上清。
PBS 洗涤：每孔加入 100 µL 预冷 PBS 轻轻洗涤一次，吸干残留液（残留培养基中的酚红和血清会抑制荧光素酶活性并淬灭发光）。
加裂解液：每孔加入 30–50 µL 的 1× PLB 裂解液。
振荡裂解：将 96 孔板置于室温水平摇床上，轻柔摇晃（150–200 rpm）15–20 分钟，确保细胞完全裂解。
（可选/悬浮细胞）：悬浮细胞需离心沉淀后弃上清，加 1× PLB 吹打重悬，室温放置 15 分钟，随后 12,000×g、4 ℃ 离心 5 分钟取上清。
3.6 发光检测与数据分析
本流程按标准手动加样模式或带自动进样器（Injector）的酶标仪进行说明。
1. 酶标仪检测参数设定
检测模式：化学发光（Luminescence / Bio-Luminescence）。
测量时间 (Integration Time)：2–10 秒（常用 5 秒）。
延迟时间 (Delay Time)：2 秒（加底物后延迟 2 秒开始读数，待催化反应达到稳定峰值）。
进样器设定（若有）：进样器 A 设定体积 100 µL (LAR II)；进样器 B 设定体积 100 µL (Stop & Glo®)。
2. 标准手动操作检测步骤（以单孔连续检测为例）
吸取 10–20 µL 细胞裂解上清至全不透明白色 96 孔板底部。
避光加入 100 µL 室温平衡的 LAR II 试剂，用移液器快速吹打 2–3 次混匀（或轻击板壁）。
立即将检测板放入酶标仪中，读取 Firefly 荧光素酶读数 (MFirefly)。
取出检测板，加入 100 µL Stop & Glo® 试剂，吹打混匀。
再次放入酶标仪中，读取 Renilla 荧光素酶读数 (MRenilla)。
3. 数学计算与归一化步骤
对每一孔（包括重复孔），计算 Firefly 与 Renilla 读数的比值，消除转染效率差异：
RLUratio = Read 1 (MFirefly) ÷ Read 2 (MRenilla)
对每组的复孔（通常为 3 个复孔 n=3）计算平均值 (RLU) 与标准差 (SD)。
以对照组 (Control Group, 如 NC mimic 组) 的 RLU 为基准（定为 1.0），计算各实验组的倍数变化：
Relative Activity (Fold Change) = RLUratio (Sample) ÷ RLUratio (Control)
使用 GraphPad Prism 软件输入各复孔的最终 Fold Change 数据。
统计方法：两组间比较采用 Student’s t-test；多组比较采用 One-way / Two-way ANOVA。
作图要求：绘制带有 Error Bar (Mean ± SD) 的柱状图，标明统计学显著性标示（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001）。
四、常见问题与注意事项
4.1 常见问题排查 (Troubleshooting)
双荧光素酶实验常见问题排查
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异常现象 |
可能原因 (Potential Causes) |
推荐解决措施 (Recommended Solutions) |
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1. 两个信号 (Firefly/Renilla) 均极低或读数为 0 |
1. 细胞转染极差或完全未转染成功 |
1. 增加阳性转染对照，优化转染体系 |
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2. Firefly 信号极强，但 Renilla 信号极低 |
1. 内参质粒 pRL-TK 加量太少 |
1. 调整共转染比例（如由 50:1 调至 20:1） |
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3. Renilla 内参发光波动巨大 (CV > 30%) |
1. 内参启动子受到处理因素（如药物/转录因子）的反式调控 |
1. 更换不含竞争元件的内参启动子（如将 CMV 启动子换为 TK 启动子） |
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4. 复孔之间发光读数差异大 |
1. 裂解不均匀或吸取上清体积不一致 |
1. 保证摇床上裂解满 15 分钟 |
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5. 背景发光值偏高 (Blank Signal High) |
1. 误用了透明板发生严重孔间发光串扰 |
1. 必须使用全不透明白色 96 孔板 |
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6. WT 组与 MUT 组均被抑制 (无特异性) |
1. miRNA mimic/siRNA 浓度过高导致毒性/非特异压制 |
1. 降低 mimic 浓度（从 50 nM 降至 10–20 nM） |
4.2 关键注意事项总结
板型选择是红线：发光检测必须使用全不透明白色 96 孔板。切忌使用透明板或黑色板！
内参启动子干扰 (Promoter Crosstalk)：强烈转录激活因子可能通过竞争细胞内通用转录因子（如 TBP, p300）而抑制内参 pRL-TK/SV40 的表达。如果发现加药或加转录因子后 Renilla 读数显著降低，需减少内参质粒加量或更换内参启动子。
信号衰减动力学 (Decay Kinetics)：本试剂盒产生的闪光/半持久发光信号存在半衰期（通常在加底物后 10–15 分钟内衰减 50%）。因此，加样后必须在 2–5 分钟内完成读数；若样品量极大，建议采用“分批加样”或使用带“自动进样器”的仪器。
培养基残留与酚红效应：裂解前用 PBS 洗涤细胞不可省略。酚红会严重吸收 480–560 nm 波段的发光，导致读数衰减 20%–50%。
