第一部分  基础篇：认识 Pull-down

第 1 章  引言

1.1 手册适用范围与读者对象

本手册旨在为从事分子生物学、生物化学、细胞生物学及蛋白质组学研究的初学者（如新入实验室的研究生、科研助理及技术人员）提供一份系统、规范且具备高度实操性的 Pull-down 实验指导指南。手册涵盖蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）、蛋白质-核酸（DNA/RNA）相互作用的基本原理、实验设计、标准操作流程（SOP）、数据分析及故障排查（Troubleshooting）。

1.2 蛋白-蛋白相互作用研究概览

生命活动（如信号转导、基因转录、细胞周期调控及代谢网络）高度依赖于蛋白质之间的相互作用。探究 PPI 不仅有助于阐明生物学机制，还能为药物靶点的筛选与验证提供关键分子证据。目前研究 PPI 的方法主要分为两大类：

体外（In vitro）重组验证：Pull-down、表面等离子体共振（SPR）、微量热泳动（MST）、等温滴定微热重分析（ITC）。

体内（In vivo）/原位（In situ）验证：共免疫沉淀（Co-IP）、酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）、邻近标记技术（BioID/APEX）。

1.3 Pull-down 的定义与定位

Pull-down 实验是一种基于亲和层析（Affinity Chromatography）技术的体外（In vitro）验证或筛选互作分子的方法。其核心逻辑是利用已知固定化的“诱饵”（Bait）去“钓取”溶液中能够与其特异性结合的“靶标/猎物”（Prey）。

在 PPI 研究的方法树中，Pull-down 占据着判断直接相互作用（Direct Interaction）金标准的地位。

第 2 章  原理与机制

2.1 亲和纯化基本概念

Pull-down 的物理化学基础是高选择性的非共价亲和结合。

亲和标签（Affinity Tag）：通过基因工程融合表达在诱饵蛋白上的特定肽段或蛋白质（如 GST、6×His、Flag、Biotin 等）。

固相载体（Solid Matrix）：偶联了标签特异性配体（Ligand）的琼脂糖凝胶珠（Agarose Beads）或磁珠（Magnetic Beads）。例如：谷胱甘肽（Glutathione）用于结合 GST 标签；镍离子（Ni-NTA）用于结合 His 标签。

特异性结合与洗脱：Bait 蛋白借助其标签固定在固相载体上，捕获 Prey 后，通过改变缓冲液的离子强度、pH 或加入竞争性小分子，将 Bait-Prey 复合物洗脱。

2.2 Pull-down 的作用原理

Pull-down 实验按以下三个步骤进行：

第一步，固定诱饵（Bait Immobilization）：将带有亲和标签的 Bait 蛋白与固相载体孵育，使其牢固结合在磁珠/凝胶上。

第二步，捕获靶标（Prey Capture）：加入含有 Prey 蛋白的裂解液或纯化蛋白溶液，过夜或短时间孵育，使 Bait 与 Prey 发生相互作用，形成 Bait-Prey 复合物。

第三步，洗涤与洗脱（Washing & Elution）：利用特定洗涤缓冲液洗去未结合及非特异性吸附的杂蛋白；随后加入竞争性配体或变性加载缓冲液，破坏结合作用，收集洗脱液（Bait 与 Prey）用于后续检测分析。

2.3 与 Co-IP 的比较

Pull-down 与 Co-IP 的比较

比较维度	Pull-down 实验	共免疫沉淀（Co-IP）实验
实验环境	主要为体外（In vitro）系统	细胞或组织内（In vivo/Ex vivo）环境
结合类型	验证直接相互作用（若均用纯化蛋白）	验证直接或间接复合物相互作用
蛋白来源	体外重组表达纯化蛋白，或纯化 Bait + 细胞裂解液	原位细胞/组织裂解液（内源性或过表达）
捕捉介质	亲和磁珠/凝胶（配体-标签识别）	抗体偶联 Protein A/G 磁珠/凝胶
生理相关性	较弱（需体外重建生理条件）	强（反映细胞内真实生理/病理状态）
干扰因素	易受体外折叠、溶解度及非特异性结合影响	易受抗体交叉反应、细胞裂解效率影响
优势	定量准确，易于映射互作结构域	真实反映内源性蛋白质复合物状态

2.4 Pull-down 的类型

根据研究对象与亲和体系，Pull-down 主要分为两大类：

蛋白-蛋白相互作用（PPI）体系：GST Pull-down（GST-谷胱甘肽体系）、His Pull-down（6×His-Ni-NTA 体系）、Biotin/Streptavidin 体系、Flag/HA/Myc 等免疫亲和体系。

蛋白-核酸相互作用（PNA）体系：DNA Pull-down（双链/单链 DNA 探针）、RNA Pull-down（体外转录/带标记 RNA）。

第二部分  实操篇：标准操作流程

第 4 章  实验前准备

4.1 实验设计原则

完整的 Pull-down 实验必须包含严谨的对照体系：

阴性对照组 1（Bait 标签对照）：仅表达并固定纯 GST 标签（或纯 His 标签），用于排除 Prey 与标签蛋白本身的非特异性结合。

阴性对照组 2（载体/磁珠对照）：未偶联任何蛋白的空白磁珠/凝胶 + Prey，用于检测 Prey 对固相载体基质的非特异性吸附。

实验组（Bait-Tag + Prey）：测试诱饵与靶标的结合。

输入组（Input）：保留 5%–10% 的 Prey 原始裂解液或重组蛋白，作为 WB 或染色的阳性参照，证实 Prey 在体系中的起始表达量及完整性。

上清/未结合组（Flow-Through / Unbound）：反应后的上清液，用于评估结合效率及饱和度。

4.2 诱饵蛋白的表达与纯化

表达系统选择：大肠杆菌（E. coli BL21 (DE3)）是最常用的表达宿主。若蛋白质需复杂的翻译后修饰（如糖基化、特定磷酸化），可选择昆虫细胞（SF9）或哺乳动物细胞（HEK293T）。

蛋白质量质控：纯度检查通过 SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色，确保 Bait 纯度 >85%；状态评估需排除严重降解或聚集（可通过排阻色谱 SEC 评估）。变性沉淀的 Bait 会导致大量的假阳性非特异吸附。

4.3 细胞裂解液制备

收集细胞：冰上预冷的 PBS 洗涤细胞 2–3 次，刮取或离心收集细胞沉淀。

重悬裂解：按 1×10⁷ 细胞加入 0.5–1.0 mL 含抑制剂的冷裂解液。

冰上孵育与超声：冰上放置 30 min，期间每 10 min 颠倒混匀一次。可辅助温和超声（功率 20%，超声 2 s，间隔 4 s，累计 1–2 min），以降低 DNA 导致的粘稠度。

澄清：4 ℃，15,000×g 离心 20 min，小心吸取上清移入冷低吸附 EP 管中，废弃沉淀。

4.4 蛋白浓度测定与样本标准化

使用 BCA 蛋白定量试剂盒测定裂解液浓度。

用裂解缓冲液将各组 Prey 裂解液的浓度调整至一致（通常建议总蛋白浓度在 1.0–3.0 mg/mL 之间）。

取出 50 μL 加入 SDS-PAGE 加样缓冲液，95 ℃ 加热 10 min，作为 Input 样品储存。

第 5 章  核心操作步骤（以 GST Pull-down 磁珠法为例）

5.1 步骤总览

磁珠预处理与洗涤 → 偶联 GST / GST-Bait（4 ℃ 1–2 h）→ 洗涤 3 次去除未结合 Bait → 加入 Prey（4 ℃ 过夜）→ 洗涤 4–6 次 → 洗脱（GSH 或煮沸）→ SDS-PAGE / WB 检测。

5.2 磁珠预处理与平衡

充分重悬：轻柔颠倒谷胱甘肽磁珠悬液，使其完全混匀。

取样与磁分离：吸取 30 μL 磁珠悬液（约 15 μL 净磁珠体积）至低吸附 EP 管中。置于磁力架上静置 30 秒，待液体澄清后吸弃防腐保存液。

平衡：加入 500 μL 冰上预冷的 Binding Buffer，颠倒清洗，磁分离弃上清。重复 2–3 次。

5.3 诱饵蛋白与磁珠的结合

加样：向平衡好的磁珠中加入重组纯化的 GST 蛋白（对照组，约 5–10 μg）或 GST-Bait 融合蛋白（实验组，等摩尔量，约 10–20 μg），用 Binding Buffer 补足体积至 200–500 μL。

孵育：置于垂直旋转混匀仪上，4 ℃ 缓缓旋转孵育 1–2 小时（或室温 30 分钟）。

洗涤去除游离 Bait：磁分离，保留少量上清用于检测偶联效率。用 Wash Buffer 洗涤磁珠 3 次（每次 500 μL，颠倒混匀或短暂停留 3 min）。

5.4 裂解液/Prey 孵育（捕获互作蛋白）

加入 Prey：向已绑定 GST 或 GST-Bait 的磁珠沉淀中，加入制备好的 Prey 样品（如 500 μL 细胞裂解液或 2–5 μg 重组纯化的 Prey 蛋白）。

结合孵育：将管固定于旋转混匀仪上，4 ℃ 下温和翻转孵育 2–4 小时（若结合力较弱可过夜孵育 12–16 小时）。

5.5 洗涤去除非特异性结合

磁分离：孵育结束后，置于磁力架上，吸取上清保存（Flow-Through 组）。

洗涤（关键步骤）：加入 800 μL 洗涤缓冲液（Wash Buffer），翻转混匀 5 min，磁分离弃上清。重复洗涤 4–6 次。

换管：在最后一次洗涤时，将洗涤悬液转移至一个新的低吸附 EP 管中。目的是消除管壁塑料吸附的杂蛋白在洗脱时被一同洗下的干扰。

5.6 洗脱与收集

温和洗脱：向洗净的磁珠沉淀中加入 30–50 μL 新鲜配制的 GST 洗脱缓冲液（15 mM GSH, pH 8.0），4 ℃ 或室温摇床温和震荡 15–30 min。磁分离，小心收集上清（含有 GST/GST-Bait 及捕获的 Prey 复合物）至新管中。

煮沸洗脱：向洗净的磁珠沉淀中直接加入 30–40 μL 1× SDS-PAGE Loading Buffer（或 2× 缓冲液按比例稀释），涡旋混匀，95–100 ℃ 金属浴加热 8–10 min。迅速离心并将管置于磁力架上，吸取上清作为洗脱样品（Eluate）进行电泳。

5.7 关键操作参数汇总表

关键操作参数汇总表

步骤	操作温度	时间	转速/震荡条件	体积	关键注意事项
磁珠平衡	4 ℃ / RT	3 min × 3 次	手动颠倒混匀	500 μL / 次	磁分离须待液体完全澄清
Bait 偶联	4 ℃	1–2 h	10–15 rpm 垂直翻转	200–500 μL	避免产生气泡；Bait 量切忌过饱和
Prey 孵育	4 ℃	2–4 h（或过夜）	10–15 rpm 垂直翻转	500–1000 μL	时间过长易增加非特异背景
洗涤	4 ℃	5 min × 5 次	20 rpm 翻转洗涤	800 μL / 次	最后一次洗涤必须更换新 EP 管
煮沸洗脱	95–100 ℃	8–10 min	1000 rpm 剧烈震荡	30–50 μL	变性后磁分离须趁热进行，防止蛋白复性沉淀

第 6 章  下游检测与数据分析

6.1 SDS-PAGE + 考马斯亮蓝染色

目的：评估 Bait 蛋白的表达量、偶联效率以及整体富集谱线。

操作要点：制作 10%–12% SDS-PAGE 凝胶（根据 Bait 和 Prey 相对分子质量调整梯度）；上样顺序建议为 Marker | Input | GST 洗脱 | GST-Bait 洗脱；电泳结束后，脱色摇床上考马斯亮蓝 R-250 染色 30 min，脱色液脱色至背景清晰。

6.2 Western Blot 验证互作

适用于：Prey 蛋白有特异性抗体，或 Prey 带有特定融合标签（如 Myc, HA, Flag）。

加样对照设计：Lane 1 为 Input（5–10%）；Lane 2 为 Flow-Through（未结合组）；Lane 3 为 Control-Tag Eluate（GST 组洗脱）；Lane 4 为 Bait-Tag Eluate（GST-Bait 组洗脱）。

判读标准：只有当 Lane 4 出现强目标条带，而 Lane 3（Control）无条带或仅有极微弱背景时，方可判定存在特异性相互作用。

6.3 银染与质谱鉴定（未知伙伴鉴定）

若目的为“寻找未知互作蛋白”，需提升样品纯度与敏感度：

高灵敏度银染（Silver Staining）：检测限可达 0.5–1.0 ng，能观察到考染无法显示的微量结合蛋白。

切胶与 LC-MS/MS 质谱分析：对比发现仅在 GST-Bait 组出现而 GST 对照组没有的差异条带（Differential Band）；在无尘或超净台内无菌切下目标胶条，放入无蛋白酶 EP 管中，送质谱测序；通过生物信息学比对分析得分（Score）、覆盖率（Coverage）及肽段数（Peptide Count）。

6.4 结果解读与常见图表展示规范

典型 Western Blot / 考染结果示意如下：Input（10%）出现 Prey 条带；GST-Control Eluate 无条带（阴性对照）；GST-Bait Eluate 出现显著条带（特异信号，正结果）。

发表级图表必须标注的要素：分子量 Marker 位置（kDa）；各孔加样说明（明确标注 Input 比例，如 5% Input）；底部使用抗 GST 抗体/考染证明各组 Bait 加样量基本等量（Loading Control）。

第三部分  进阶篇：变体与应用

第 7 章  Pull-down 的类型详解与选择

7.1 His-Pull-down（Ni-NTA 体系）操作要点

原理：利用组氨酸残基（通常为 6×His）咪唑环上的氮原子与固定在基质上的 Ni²⁺ 发生配位键结合。

关键优化：结合与洗涤缓冲液中的咪唑必须包含低浓度咪唑（10–20 mM），用于有效抑制内源性富含组氨酸杂蛋白的非特异吸附；螯合剂禁忌：裂解液中严禁添加 EDTA 或 EGTA，否则会夺取磁珠上的 Ni²⁺ 导致介质失效；还原剂限制：避免使用高浓度 DTT（应 <1 mM），建议改用 TCEP（0.5–1 mM）。

7.2 Biotin-Streptavidin 体系与核酸 Pull-down

DNA Pull-down：探针制备时合成 5′-端生物素（Biotin）标记的双链 DNA 探针（如包含转录因子结合 Motif 的序列）；流程为将生物素化 DNA 偶联至链霉亲和素磁珠（Streptavidin Magnetic Beads），加入核蛋白提取物/裂解液，孵育洗涤，洗脱电泳检测。

特异性对照：加入 50–100 倍过量的未标记冷竞争 DNA 探针（Cold Competitor）或突变 Motif 探针，若结合信号消失，证明该结合具备序列特异性。

RNA Pull-down：探针制备采用体外转录（In vitro transcription）掺入 Biotin-UTP 生成带标记的 RNA。注意事项：全程需在严格 RNase-free 环境中操作，缓冲液使用 DEPC 水配制，并加入 RNase 抑制剂（如 RNaseOUT, 40 U/mL）。

7.3 串联亲和纯化（TAP-tag）等复合方法

针对高背景或低亲和力复合物，采用双重标签融合（如 Flag-HA 或 Protein A-CBP）：通过第一轮结合-洗脱后，不经过变性，直接进入第二轮亲和结合。这能极大降低背景假阳性，获得超高纯度的完整内源性超分子复合物。

7.4 不同标签的优缺点对比与选型决策表

不同亲和标签的优缺点对比与选型决策表

亲和标签	分子量	配体介质	洗脱条件	优势	劣势与局限	最佳适用场景
GST	~26 kDa	Glutathione Beads	10–20 mM GSH（温和）	溶解性高，助溶效果好；结合力极强	分子量大，可能产生空间位阻，易自聚成二聚体	重组纯化蛋白间的体外直接互作验证
6×His	~1 kDa	Ni-NTA / Co-NTA	250–500 mM Imidazole	标签极小，对蛋白质折叠与功能干扰极低	非特异结合背景较高；对螯合剂/还原剂敏感	原核重组表达蛋白、变性条件下的纯化
Flag	~1 kDa	Anti-Flag Antibody Beads	Flag 多肽竞争或酸性 pH	结合高度特异；背景极低	成本极高；抗体载体负载量有限	哺乳动物细胞内源或低表达蛋白捕获
Biotin	小分子	Streptavidin Beads	煮沸变性或高浓度游离生物素	结合亲和力极高（Kd ≈ 10⁻¹⁵ M）	结合几乎不可逆，非变性洗脱极困难	核酸（DNA/RNA）Pull-down、微量靶标捕获

第 8 章  特殊场景与改造

8.1 研究结构域/突变体结合的 Pull-down

为精确映射 PPI 的分子界面（Domain Mapping）：

截短体设计（Truncation Construction）：构建基于蛋白结构域预测的片段（如 N-端截短、C-端截短、单一 Domain）。

点突变（Point Mutation）：根据晶体结构或对接（Docking）模型，将关键结合位点氨基酸突变（如带电氨基酸突变为丙氨酸 Ala）。

结果判读：比较 Wild-type（WT）与各 Mutation 在相同 Bait 量下的 Pull-down 信号强度差异，即可锁定互作的核心结构域或关键残基。

8.2 竞争性 Pull-down（Competitor Pull-down）

用于评估结合特异性或测定小分子/多肽阻断效果：在 GST-Bait + Prey 体系中，梯度加入合成的游离竞争多肽（Peptide）或合成小分子化合物；分析 Prey 被逐步置换、结合量减少的趋势（剂量依赖性衰减），可用于计算 IC₅₀，为小分子靶向阻断剂的研制提供依据。

8.3 交叉验证方案设计

在科研论文中，单一 Pull-down 实验不足以形成完整证据链，需构建“三位一体”的验证体系：

体外直接互作验证：Recombinant GST Pull-down（纯蛋白）；细胞内生理互作验证：Co-IP（内源性或双过表达）；细胞内空间共定位验证：免疫荧光（IF Co-localization）。

第四部分  故障排查与质量管理

第 9 章  常见问题与解决方案（Q&A）

常见问题与解决方案对照表

序号	实验现象	根本原因分析	针对性解决方案
1	对照组（仅有标签）出现强 Prey 信号	1. Prey 对 GST 标签有特异结合；2. Prey 与磁珠/凝胶基质非特异吸附；3. 裂解液中 Prey 浓度过高或胶体聚沉	1. 改用 His 或 Flag 标签重新验证；2. 增加预清步骤（Pre-clearing）：预先用空白磁珠孵育裂解液；3. 洗涤液中增加盐浓度（如 NaCl 提升至 300–500 mM）或增加去污剂（0.5% Triton X-100）；4. 降低 Prey 上样量
2	目标 Prey 在洗脱组中完全检测不到（假阴性）	1. Bait 与 Prey 相互作用极其微弱或瞬时（Transient）；2. Bait 蛋白体外折叠错误，结合位点被包埋；3. 洗涤条件过于剧烈，破坏了结合；4. Prey 蛋白在裂解过程中被降解	1. 尝试使用化学交联剂（如 DSP 或 EGS）预处理以固化瞬时结合；2. 降低洗涤缓冲液中的去污剂与盐浓度；3. 缩短洗涤时间，全程严格 4 ℃ 操作；4. 补足蛋白酶抑制剂，尝试更换不同表达系统重组纯化 Prey
3	SDS-PAGE 显示杂带极多、背景过高	1. 磁珠洗涤不彻底；2. EP 管壁吸附的杂质在煮沸洗脱时一同脱落；3. 细胞裂解液未澄清充分	1. 增加洗涤次数（洗涤 5–6 次）；2. 在最后一次洗涤时务必更换新 EP 管后再煮沸；3. 离心速度提升至 15,000 g，离心 30 min，只吸取中间清亮裂解液
4	GST-Bait 无法偶联到谷胱甘肽磁珠上	1. 结合缓冲液 pH 值偏离（如 <6.5 或 >8.5）；2. GSH 磁珠重复使用失效；3. GST 标签被包埋或诱饵蛋白发生严重聚集沉淀	1. 校准 Buffer pH 至 7.4–7.5；2. 使用新鲜配制/未过期的磁珠；3. 裂解液中加入温和去污剂（如 0.1% CHAPS）以增加蛋白溶解度
5	Bait 蛋白在孵育过程中严重降解/断裂	1. 重组纯化 Bait 本身不稳定；2. 裂解液中内源性蛋白酶活性过高；3. 孵育时间过长	1. 纯化 Bait 后加入甘油，分装 -80 ℃ 保存，避免反复冻融；2. 裂解液现加双倍剂量的 PMSF 及 EDTA-free Cocktail；3. 将过夜孵育缩短至 4 ℃ 孵育 1–2 小时

第 10 章  对照与质控

10.1 必备对照组设置

为了确保数据的严密性，一套完整的 Pull-down 实验必须在同一凝胶/WB 膜上展示以下对照：

Lane 1：Marker；Lane 2：Input（5%–10% 的 Prey 原液），证明 Prey 表达量与抗体有效性；Lane 3：Empty Beads + Prey，评估基质非特异吸附；Lane 4：Tag-Control（如 GST）+ Prey，评估标签非特异吸附；Lane 5：Bait-Tag（如 GST-Bait）+ Prey，测试特异性相互作用；Lane 6：Flow-Through（未结合上清），评估结合饱和度与效率。

10.2 重复性与批次间稳定性

生物学重复：任何 Pull-down 结论必须基于至少 3 次独立的生物学重复实验（利用不同批次表达纯化的蛋白或不同批次提取的细胞裂解液）。

磁珠批次控制：新采购或更换不同批号的磁珠时，需预先进行空白磁珠吸附测试，确保批次间的背景信号一致。

10.3 结果可靠性判断标准

在将 Pull-down 结果判定为“阳性互作”前，必须同时满足以下条件：

特异性条件：Bait 组的 Prey 信号强度显著高于 Tag 对照组（灰度值定量对比计算，原则上需具有 5 倍以上差异，P < 0.05）。

剂量依赖性（建议验证）：增加 GST-Bait 的投入量，被洗脱的 Prey 信号呈线性递增。

化学/结构特异性：特异性突变关键位点或加入竞争多肽后，结合信号被显著削弱或完全消失。