一、实验原理概述
免疫共沉淀（Co-IP）是在天然非变性状态下验证或捕获细胞内蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的实验方法。
其原理链条为：利用特异性抗体结合样品中的靶蛋白及其天然结合的互作蛋白复合物，再通过 Protein A/G 磁珠/琼脂糖珠捕获“抗原-抗体”复合物，经过洗涤去除非特异性结合杂质后洗脱复合物，最后利用 Western Blot（WB）检测沉淀中的目的蛋白及互作蛋白。
二、实验材料与试剂
（一）抗体与对照
1. IP 用抗体：靶蛋白特异性抗体（需注明种属及单克隆/多克隆类型）。
2. WB 用抗体：用于后续检测靶蛋白及互作蛋白的 WB 一抗与二抗。
3. 同型对照 IgG（阴性对照）：与 IP 用一抗同种属、同类型的 Normal IgG（如 Normal Rabbit IgG 或 Normal Mouse IgG）。
（二）裂解与洗涤试剂
1. IP 细胞裂解液（温和去污剂配方）：50 mM Tris-HCl (pH 7.4)，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1% NP-40（或 0.5% Triton X-100），10% 甘油。
2. 抑制剂：100× 蛋白酶抑制剂混合物（Protease Inhibitor Cocktail）、1 mM PMSF；若检测磷酸化介导的互作，需添加 100× 磷酸酶抑制剂混合物。
（三）固相基质及缓冲液
1. Protein A/G Beads：Protein A/G 磁珠（Magnetic Beads）或 Protein A/G 琼脂糖凝胶珠（Agarose Beads）。
2. 常用缓冲液：1× PBS (pH 7.4)、5× SDS 上样缓冲液（含 DTT 或 β-巯基乙醇）。
三、细胞培养与处理
根据实验目的设置影响蛋白相互作用的细胞处理及干预条件：
1. 处理与刺激条件：记录细胞类型、接种密度及处理参数。如加入特定药物、配体或抑制剂处理（注明具体浓度与作用时间）；或进行基因过表达（质粒转染，如带有 Flag/HA/Myc 标签）及基因敲低/敲除（siRNA/shRNA）。
2. 收样节点：转染后 24–48 h 或药物处理完毕后收样，收样前确认细胞状态良好（存活率 >90%）。
四、蛋白样品制备（细胞裂解）
1. 配制含抑制剂的裂解液：临用前向冷 IP 裂解液中加入终浓度 1× 的蛋白酶抑制剂 Cocktail、1 mM PMSF 及磷酸酶抑制剂。
2. 注意：必须使用温和去污剂（如 NP-40 或 Triton X-100），避免使用含高浓度 SDS 或脱氧胆酸钠的变性裂解液（如强 RIPA），防止破坏非共价蛋白复合物。
3. 细胞裂解操作：
（1）弃去培养基，用预冷的 1× PBS 洗涤细胞 2 次，吸干残液。
（2）每 10 cm 培养皿加入 500–800 μL 预冷的 IP 裂解液，用细胞刮刮下细胞，转移至 1.5 mL 离心管中。
（3）置于冰上静置裂解 30 min，每隔 10 min 颠倒混匀一次；必要时可配合低功率温和超声（2–3 次，每次 2–3 s，冰上操作）。
4. 离心澄清：在 4 ℃、12,000 × g 条件下离心 15 min，小心吸取澄清的上清液转移至新管中，弃去沉淀。
五、蛋白浓度测定与 Input 对照
1. 蛋白浓度测定：取少量裂解上清，采用 BCA 或 Bradford 法测定总蛋白浓度，并用裂解液将各组蛋白浓度调至一致（建议总蛋白浓度为 1.5–3.0 mg/mL）。
2. 保留 Input 样品（必做）：
（1）从调匀的各组总蛋白上清中取出 5%–10% 的体积（如 30–50 μL）作为 Input 对照样品。
（2）向 Input 样品中加入 5× SDS 上样缓冲液，95–100 ℃ 煮沸变性 10 min，保存于 -20 ℃，用于证明各处理组初始输入量一致。
六、预清除（Pre-clearing，可选）
若样品非特异性结合较强或背景较高，可增加预清除步骤：
按 500 μL 裂解上清加入 20 μL 预洗涤的未偶联抗体空白 Protein A/G beads，在 4 ℃ 旋转孵育 1 h；离心（2,500 × g，1 min）或磁分离，取上清进行后续 IP。若样品背景较低，此步骤可省去。
七、免疫沉淀（IP 核心步骤）
根据结合顺序选择以下一种操作方式：
（一）方式 A：抗体先与裂解液孵育，再加 Beads（推荐）
1. 抗体孵育：取等量总蛋白上清（1–2 mg），实验组加入 1–4 μg IP 特异性一抗；对照组加入等质量（1–4 μg）的同种属同型 IgG。置于 4 ℃ 旋转混匀仪上孵育过夜（12–16 h）或 4 ℃ 孵育 2–4 h。
2. Beads 结合：加入 20–30 μL 预洗涤好的 Protein A/G beads，4 ℃ 继续旋转孵育 2–4 h。
（二）方式 B：抗体先与 Beads 偶联，再与裂解液孵育
先将 1–4 μg 抗体与 20–30 μL Protein A/G beads 在 4 ℃ 旋转孵育 2 h，洗涤去未结合抗体后，再加入蛋白裂解液中，4 ℃ 旋转孵育过夜。
八、洗涤
1. 洗涤缓冲液配方：使用 IP 洗涤液（如 50 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，0.1% NP-40）或冷 IP 裂解液。
2. 洗涤方式：
（1）磁分离或低速离心（4 ℃，2,500 × g，1 min）沉淀 Beads，弃去上清。
（2）加入 800–1000 μL 冷洗涤液，4 ℃ 颠倒清洗或旋转洗涤 5 min，弃上清。
（3）重复洗涤 4–5 次，最后一次洗涤尽可能吸干残液。
3. 洗涤严谨度（Stringency）调控：
（1）较高盐浓度（150–300 mM NaCl）与去污剂（0.1% NP-40）可降低非特异吸附背景。
（2）若蛋白质相互作用较弱，需适当降低洗涤盐浓度（150 mM）并减少洗涤时间，防止结合破坏。
九、洗脱与样品制备
（一）煮沸变性洗脱（变性 WB 常用）
洗涤完成后，向 Beads 沉淀中直接加入 30–40 μL 1× SDS 上样缓冲液（含 100 mM DTT 或 5% β-巯基乙醇），95–100 ℃ 煮沸变性 10 min。磁分离或离心收集上清，即为 IP 洗脱样品。
（二）低 pH 或竞争性温和洗脱（非变性检测需求）
1. 低 pH 洗脱：加入 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.5–3.0) 孵育洗脱 5–10 min，收集上清后立即加入 1/10 体积的 1 M Tris-HCl (pH 8.5) 进行中和。
2. 竞争性洗脱：使用过量竞争性多肽（如 3×Flag 多肽，100–200 μg/mL）在 4 ℃ 旋转孵育 1–2 h 洗脱。
十、SDS-PAGE 与 Western Blot 检测
1. 上样与电泳：取 Input 样品（5%–10%）与全部/部分 IP 洗脱样品（含 IgG 组样品）同板进行 SDS-PAGE 电泳，转印至 PVDF 膜。
2. 封闭与抗体孵育：
（1）5% 脱脂奶粉或 3% BSA 封闭 1 h。
（2）一抗孵育：按比例稀释（如 1:1000）针对目的蛋白及互作蛋白的一抗，4 ℃ 孵育过夜。
（3）二抗孵育：洗膜后加入 HRP 标记的特异性二抗（如 1:5000），室温孵育 1 h，ECL 发光显影。
十一、对照设置
1. Input 对照：输入蛋白总量对照，证实各样品在沉淀前目标蛋白与互作蛋白的表达水平一致。
2. IgG 同型阴性对照：证明沉淀出的蛋白质为特异性结合，而非抗体骨架或 Beads 的非特异性吸附。
3. 特异性验证对照（视研究需要）：
（1）反向 Co-IP：互换 IP 与 WB 抗体进行双向交叉沉淀验证。
（2）基因敲低/突变体对照：在靶蛋白 Knockdown/Knockout 组或结构域突变（Mutant）组中观察互作信号是否消失。
十二、结果分析与数据呈现
1. 条带判断标准：
（1）Input 组中，目的蛋白与互作蛋白均有清晰阳性条带。
（2）IP 沉淀组中，目的蛋白阳性（证实 IP 沉淀成功），且同时富集出互作蛋白条带。
（3）IgG 阴性对照组中，目的蛋白与互作蛋白均无条带（或仅有极低背景）。
2. 重复性要求：实验需进行至少 3 次独立的生物学重复（n = 3）。
3. 定量分析（如需）：使用 ImageJ 分析 WB 条带灰度，计算相对结合量 = IP 目的蛋白灰度 / IP 互作蛋白灰度。
十三、常见问题与注意事项
1. 假阳性（非特异性结合高）：
（1）原因：洗涤严谨度不足、Beads 吸附、或抗体用量过大。
（2）处理：提高 Wash Buffer 盐浓度（150–300 mM），增加洗涤次数，增加预清除（Pre-clearing）步骤，或减少抗体用量。
2. 假阴性（未沉淀出互作蛋白）：
（1）原因：裂解液去污剂太强破坏了复合物、洗涤过度、或抗体结合表位遮挡了结合位点。
（2）处理：改用更温和的裂解液（如 0.5% NP-40），降低洗涤盐浓度，或更换结合不同表位的 IP 抗体/使用 Tag 标签沉淀。
3. 抗体重链/轻链干扰：
（1）原因：洗脱时抗体重链（约 55 kDa）和轻链（约 25 kDa）一同洗脱，掩盖相同分子量的目的蛋白。
（2）处理：使用抗轻链/重链特异性二抗；或在 IP 前将抗体与 Beads 进行化学共价交联（如用 BS3 交联）。
