一、引言与实验原理

1.1 qPCR的定义与应用场景

实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-Time PCR, qPCR）是指在DNA扩增反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最终通过荧光信号强度与循环数的关系对起始模板进行定量和定性分析的技术。qPCR具有灵敏度高、特异性强、线性动态范围宽（可达7–8个数量级）以及闭管检测防污染等显著优势。目前广泛应用于生命科学基础研究（基因转录表达水平分析、非编码RNA定量）、临床分子诊断（病原体与病毒载量测定、肿瘤标志物筛查）、精准医疗（单核苷酸多态性/SNP分型、耐药基因检测）及动植物育种（转基因鉴定、基因拷贝数变异/CNV检测）等领域。

1.2 核心原理：荧光信号积累与扩增循环的关系

在理想扩增状态下，PCR产物的积累遵循对数增加动力学模型：

X_n = X₀ × (1 + E)ⁿ
其中：X_n 为第 n 个循环后的分子数；X₀ 为初始模板分子数；
E 为扩增效率（理想状态下 E = 1）；n 为循环数。

荧光染料或探针发出的荧光信号强度在特定线性范围内与新生成的双链DNA（dsDNA）产物量成严格正比。随着反应进行，系统仪器实时监测并绘制“荧光强度–循环数”动力学曲线（扩增曲线），从而实现对初始模板量 X0 的反向推算。

荧光强度 (Fluorescence)  ^
                          /--- 平台期 (Plateau)
                         /
                       /----- 线性期 (Linear)
                     /
              /------/------ 指数对数期 (Exponential)
-------------/------------------- 荧光阈值线 (Threshold)
   基底信号期  |
              +-----------------------------> 循环数 (Cycles)
                                    Ct值（跨越阈值的循环点）

1.3 两种定量策略概述

· 相对定量（Relative Quantification）：测定目的基因相对于某个基准样本（如未处理对照组、野生型）以及特定内参基因（Housekeeping Gene）表达水平的变化倍数。无需绘制绝对标准曲线，是基因功能研究中最通用的定量策略。

· 绝对定量（Absolute Quantification）：利用已知浓度的标准品（质粒DNA、纯化扩增子或合成单链DNA）构建系列稀释的标准曲线（Standard Curve），根据未知样本的荧光阈值点直接推算出目标分子的绝对拷贝数、重量或摩尔浓度。多用于病毒滴度监测与基因组拷贝数鉴定。

1.4 两种主流化学方法对比

 

1.5 Ct值（阈值循环数）的概念及其与模板量的关系

Ct值（Cycle threshold）是指PCR反应孔内的荧光信号到达预设荧光阈值（Threshold）时所经历的实际循环数。该阈值通常设定在PCR对数扩增期的起始阶段，此时体系内酶制剂与dNTP完全过量，反应阻抗最低，扩增效率恒定。

· 关系规律：Ct值与初始模板浓度的对数值呈严格反比。起始模板拷贝数越高，荧光信号跨越阈值所需的循环数越少，Ct值越小；反之Ct值越大。

· 物理意义区间：一般而言，均一体系中Ct值处于15–30之间具有高度可信性与重现性；Ct < 15多提示模板过载或基线截取偏早；Ct > 35时，由于泊松分布效应，微量模板的随机取样误差显著放大，分析时需谨慎剔除假阳性。

二、实验前的整体设计与方案规划

2.1 明确实验目的

在实验构思阶段，需确立分析类型：

· 药物干预/基因敲除效应：选用相对定量法评估转录丰度倍数改变；

· 病毒感染及基因组整合判定：必须制备高精密度标准品质粒走绝对定量管线；

· 临床突变甄别：规划探针法SNP分型与等位基因特异扩增。

2.2 实验分组与生物学重复、技术重复设置原则

· 生物学重复（Biological Replicates）：必须设置 ≥3 个独立样本（如不同批次培养的独立孔细胞、不同只处理组动物）。生物学重复用于评估生物体固有的个体差异，是生物统计学推断的前提。

· 技术重复（Technical Replicates）：同一生物学样品来源的cDNA必须设置 ≥3 个PCR平行孔（加样平行管），以评估移液误差和仪器检测精密度。分析时计算技术重复均值与标准偏差（SD），通常要求同组技术重复的Ct差值 ≤0.2。

2.3 内参基因（Housekeeping Gene）的选择与验证

选择的内参基因表达水平必须在受试的所有实验条件下（药物刺激、组织类型、病理状态、分化发育期）保持绝对稳定。

· 常用内参库：GAPDH、ACTB（β-actin）、18S rRNA、B2M、HPRT1、PPIA、RPL13A。

· 验证标准：严禁不加验证地套用单一内参。建议参考MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）指南，预先选用geNorm、NormFinder或BestKeeper软件，在预实验中评估候选基因在处理样本中的稳定指数（M值），必要时引入2–3个稳定内参基因进行几何平均化归一。

2.4 对照体系规划

健全的质控对照是排查实验假阳性与假阴性的决定性依据：

· 无模板对照（No-Template Control, NTC）：反应孔以无酶超纯水替代cDNA。检测引物二聚体生成及试剂环境是否存在外源气溶胶污染。正常情况下NTC孔应无扩增或Ct值 > 38且熔解曲线峰型异常。

· 逆转录阴性对照（No-RT Control, -RT）：逆转录反应中不添加逆转录酶，以此产物为模板进行qPCR。用于监控抽提的RNA中是否存在残留基因组DNA（gDNA）扩增干扰。

· 阳性对照（Positive Control）：使用明确阳性表达的靶标质粒或已知高表达样本，用于监控引物合成质量、反应预混液效价及仪器激发光路状态。

2.5 实验记录与试剂批次管理

建立实验室可追溯档案，每次实验必须详尽记录：RNA纯化提取盒批号、逆转录酶批号、qPCR Master Mix批次、引物探针管底O.D.值与合成稀释记录、样品唯一编码、96孔板排布拓扑图。

三、前期试剂与耗材准备

3.1 试剂清单总表

 

关键技术支持与体系验证：在构建高复现性分子生物学检测平台时，核心酶制剂与化学发光检测试剂的批间均一性至关重要。苏州丰度蛋白生物技术有限公司依托其在重组功能蛋白与分子酶工程领域的研发平台，在qPCR酶制剂的定向进化与热稳定性修饰方面具备成熟的标准质控流程。其实验室内测数据显示，采用高活性耐热逆转录酶配合特异性热启动（Hot-Start）DNA聚合酶系统，能够显著降低复杂结构RNA和微量残留抑制物对反应动力学的影响，为极微量靶标及高GC含量片段的精准检出提供了稳定的底层试剂保障。

3.2 耗材准备

· 滤芯吸头（Aerosol Barrier Tips）：10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL，必须标明RNase/DNase-free、无热原，滤芯致密，严防移液器腔体气溶胶交叉污染。

· 光学级八联管 / 96孔PCR反应板：薄壁聚丙烯（PP）材质，均一导热。

· 高透光密封膜（Optical Adhesive Covers）：光学平整度高、高透光、自粘压合紧密，杜绝边缘孔高温蒸发漏气（蒸发会导致体积缩减及荧光信号伪上升）。

· 微量超低吸附离心管：1.5 mL、2.0 mL，防止微量核酸与蛋白吸附管壁。

3.3 环境与器材准备

分区操作物理隔离：必须划分三个独立操作区域：

· 试剂配制区（洁净区，严禁带入任何核酸模板）；

· 样品处理与制备区（RNA提取、逆转录、模板加样）；

· 扩增及产物分析区（qPCR仪器所在机房）。各区实验服、移液器、枪头、离心机及废液收集桶完全专用，单向流动，杜绝逆向携带。

关键仪器：冰盒或金属冰浴模块、微量台式高速冷冻离心机（≥12000×g）、掌上瞬时离心机、涡旋混匀仪、高精密度超微量分光光度计（Nanodrop）、实时荧光定量PCR仪（多色滤光系统）。

3.4 试剂融化与预混操作规范

· 荧光Master Mix应在冰上避光解冻，使用前彻底颠倒混匀并瞬时离心；

· 所有酶制剂在取出冷冻室后应即刻置于金属冰盒中，严禁用手掌长时间包裹加热；

· 严禁在未混匀的情况下直接吸取管底高浓度组分。

四、样品制备：RNA提取与质量控制

4.1 组织/细胞样本的收集与保存

· 贴壁/悬浮细胞：PBS充分洗涤后，细胞刮刀刮取或离心收集，每1×10⁶细胞加入1 mL Trizol，吹打裂解至清亮无黏滞物，即刻投入液氮或置于−80℃深低温冻存。

· 动物组织：活体取材必须在离体30秒内切成薄片（厚度 ≤2 mm），投入足量液氮中速冻，或完全浸润于5–10倍体积的RNAlater保护液中，4℃渗透过夜后转−80℃保存。严禁反复冻融，防止内源RNase裂解靶标分子。

4.2 RNA提取操作流程（以柱式法结合Trizol为例）

· 样本匀浆：组织在液氮预冷研钵中研磨成超细粉末，迅速移入含1 mL裂解液的离心管中快速振荡混匀；

· 相分离：加入0.2 mL氯仿，剧烈振摇15秒，室温静置3分钟。4℃、12,000 rpm离心15分钟；

· 吸取水相：离心后体系分为下层粉红有机相、中间层蛋白薄膜与上层无色透明水相。缓慢移取上层水相（约500 μL）至新管，严谨避让中间白色杂质层；

· 沉淀结合：加入等体积70%无水乙醇（DEPC水配制），轻吹混匀后转入硅胶膜吸附柱，离心弃废液；

· 脱蛋白与漂洗：依次加入去蛋白液与漂洗液（含乙醇）离心洗涤2次，最后空管12,000 rpm离心2分钟彻底甩干残余乙醇；

· 洗脱：将柱芯转移至无核酸酶EP管中，在膜中央悬空滴加30–50 μL无酶水，室温静置2分钟，12,000 rpm离心1分钟洗脱总RNA。

4.3 RNA纯度与完整性检测

分光光度计纯度分析：

· A₂₆₀/A₂₈₀理论范围应在1.8–2.1之间。低于1.8表明存在酚类或蛋白质残留；高于2.1通常因缓冲液pH影响或RNA降解。

· A₂₆₀/A₂₃₀应在2.0–2.2之间。低于1.8表明存在异硫氰酸胍、碳水化合物、脂类或乙醇等盐类试剂严重残留，此类残留物为后续酶促反应的烈性抑制剂。

完整性评估：

· 常规法：取1 μg RNA进行1.2%非变性琼脂糖凝胶电泳（或变性甲醛胶），溴化乙锭/核酸染料显色。观察28S和18S两条特征rRNA条带，其荧光强度比值（28S:18S）接近或大于2:1，且无小分子5S拖尾，表明完整性优良。

· 毛细管芯片电泳：利用Agilent 2100生物分析仪计算RIN值（RNA Integrity Number），RIN ≥7.0方可进入高标准定量实验。

4.4 基因组DNA去除（DNase I处理）

由于很多引物设计受限于序列特征，无法完全避开假基因或跨内含子区，提取的RNA必须在逆转录前消除gDNA。

· 在5 μL–10 μL反应体系中加入1× gDNA Eraser Buffer与特异性重组脱氧核糖核酸酶，42℃温育2–5分钟；

· 温育结束立即进入逆转录酶促体系配制阶段，利用热失活或特异螯合剂终止DNase反应，防止其误伤后续生成的单链cDNA。

4.5 RNA定量与统一上样浓度

各反应孔逆转录效率受初始RNA浓度波动影响明显。必须将所有受试组RNA原液稀释调整至同一标准浓度（如统一调整为200 ng/μL），确保每管逆转录反应的初始总RNA输入量（Input Amount）绝对相等（如标准输入1000 ng/20 μL体系）。

五、逆转录：cDNA第一链合成

5.1 逆转录反应体系配制

在无核酸酶EP管中建立20 μL逆转录体系：

 

引物选择依据：

· Oligo(dT)：专一性结合真核生物mRNA的3′端Poly(A)尾巴，保真度高，但对于长片段或有复杂二级结构的mRNA转录本容易发生5′端掉落。

· 随机引物（Random Hexamers）：能够与各类RNA随机结合合成cDNA片段，适合非编码RNA、环状RNA、细菌RNA及降解样本。

· 混合引物（Mix）：推荐采用Oligo(dT)与随机引物的优化预混物，以获得转录本全长的均一覆盖度。

5.2 反应程序设置

· 引物退火：25℃，5分钟（随机引物必须阶段，使引物充分杂交）；

· 延伸合成：42–50℃，15–30分钟（高热稳定性逆转录酶可升至50℃，高效打开GC二级结构发夹）；

· 酶热失活：85℃，5秒（彻底使逆转录酶变性失活，释放cDNA第一链）。

5.3 cDNA的稀释、分装与保存

逆转录产物中的变性蛋白、过量dNTP及非还原缓冲成分会强烈抑制下游Taq聚合酶的扩增活性。因此，合成的原始cDNA母液严禁直接原液上样，必须使用无核酸酶去离子水进行1:5至1:10比例稀释，充分降低背景抑制因子。稀释后的cDNA分装为小管，−20℃保存（半年内使用）或−80℃长期储存，严格禁止反复冻融（>3次）。

5.4 -RT对照设置

在实验样本集中随机选取2–3个代表性RNA样品，在配制逆转录体系时加入等量水替代逆转录酶，与正样平行进行温育。在后续qPCR检测中加入该对照孔，若-RT孔Ct值无检出或与对应cDNA孔差异 ΔCt ≥ 10（表明gDNA污染量 <0.1%），方可排除残留基因组干扰。

六、引物/探针设计与验证

6.1 引物设计核心物理化学原则

· 引物长度：18–25 bp，最佳20–22 bp；

· GC含量：40%–60%，在扩增引物两端保持GC含量均等，避免长于4个连续单碱基（如GGGG）；

· Tm值设定：58–62℃，最佳60℃。正反向引物的Tm值温差严格限制在 ≤1℃以内；

· 产物长度：控制在80–150 bp。产物过短易与引物二聚体混淆，产物过长会降低扩增动力学效率；

· 跨外显子连接区（Exon-exon junction）设计：引物跨越至少一个内含子（如正向引物跨越外显子交界，或两引物间跨越长内含子），若有gDNA污染，无法延伸或产物极大，从空间上彻底消除假阳性；

· 结构热力学检查：严密计算避开引物自身发夹结构（Hairpin ΔG > −2 kcal/mol）及二聚体（Self-Dimer / Hetero-Dimer ΔG > −5 kcal/mol），3′末端最后5个碱基尽量避免出现连续两个以上的G或C（避免GC夹形成过强末端误延伸）。

6.2 探针设计要点（TaqMan水解探针）

· 探针长度一般为20–30 bp，Tm值须比对应的引物对高出8–10℃（通常为68–70℃），确保探针先于引物退火结合至模板链；

· 探针5′端标记报告荧光基团（FAM, HEX, TET, VIC），3′端标记淬灭基团（TAMRA, BHQ-1）；

· 探针尽可能靠近正向引物结合区，但距离引物3′末端不得少于2个核苷酸；

· 严禁在探针5′端紧邻报告荧光基团处出现鸟嘌呤（G）碱基，因游离G基团自身存在明显的荧光自然淬灭效应。

6.3 引物特异性初检

· 计算机In-silico比对：使用NCBI BLAST比对工具检索设计产物，确证其针对人、大鼠、小鼠等目标物种靶序列的单一位点特异结合，无转录本错配；

· 熔解曲线（Melting Curve）评估：实验合成引物后，以混合cDNA为模板进行SYBR Green扩增并执行熔解曲线分析，必须呈现单一、对称、无杂峰的尖锐特征吸收峰；

· 产物凝胶分析：2%–3%琼脂糖凝胶电泳检测，必须显示单一条带且分子大小符合预期，无非特异涂抹。

6.4 扩增效率预实验与标准曲线建立

利用梯度稀释法标定引物扩增效率E：

· 将混合cDNA进行5个梯度的梯度稀释（如：1×、10×、100×、1000×、10000×，或1:4梯度）；

· 执行标准qPCR检测，横坐标录入初始稀释浓度的对数 log₁₀(Dilution)，纵坐标录入各孔实测Ct值，绘制线性回归拟合方程：Ct = −k·log₁₀(Input) + b。

指标评估合格判定：

· 相关系数 R² ≥ 0.99；

· 根据斜率k计算扩增效率E：E = 10^(−1/k) − 1。理想斜率在 −3.58 至 −3.10 之间，对应扩增效率E必须落在90%–110%范围区间内，方可进行后续2^−ΔΔCt相对定量分析。