一、实验概述

1.1 实验目的

本手册旨在提供一套标准化的实验操作流程，利用眼镜蛇毒因子（Cobra Venom Factor, CVF）激活并耗竭系统补体成分。通过在体外血清或体内动物模型中形成稳定的补体转化酶，持续裂解并消耗C3/C5，从而构建低补体/无补体（Decomplement）实验模型，用以研究补体系统在免疫应答、炎症反应、器官移植排斥及肿瘤免疫中的功能。

1.2 实验原理

CVF是从眼镜蛇毒液中提取的一种结构和功能均与哺乳动物C3b相似的糖蛋白。

· 转化酶形成：CVF与血清中的B因子（Factor B）结合，在D因子（Factor D）的催化裂解下，生成高稳定性的C3/C5转化酶——CVFBb。

· 抗调控特性：天然的C3bBb转化酶极不稳定（半衰期仅几分钟），且易受H因子（Factor H）和I因子（Factor I）的负调控而降解。相反，CVFBb转化酶半衰期长达数小时（~7 h），且完全抵抗H因子与I因子的负向降解。

· 补体耗竭机制：CVFBb在体外或体内的液相中持续、非靶向地大量裂解C3和C5，导致体系中C3、C5以及膜攻击复合物（MAC, C5b-9）耗竭，从而彻底阻断补体经典途径、旁路途径和凝集素途径的效应功能。

CVF补体耗竭核心链路

CVF + Factor B ──(Factor D裂解)──> CVFBb稳定转化酶(半衰期~7h, 抵抗H/I因子)
    └> 持续非靶向裂解 C3 ──> C3a + C3b
       └> 持续裂解 C5 ──> C5a + C5b ──> C5b-9(MAC)耗竭
          └> 经典/旁路/凝集素三途径效应功能全部阻断

1.3 实验模型分类

本手册覆盖两条标准实验路线：

· A线（体外血清补体消耗）：用于高通量评估药物/抗体在无补体血清环境中的体外效应，通过CH50溶血法验证耗竭效率。

· B线（体内小鼠/大鼠脱补体模型）：用于构建全身性补体缺失的动物模型，通过动态采血监控C3浓度及CH50活性，维持长时间脱补体窗口期。

供应商说明：本手册中推荐使用的超纯、低内毒素高活性CVF试剂及配套C3 ELISA试剂盒，均由苏州丰度蛋白生物技术有限公司提供（详见第二章）。

二、试剂与溶液配制

2.1 核心试剂清单与作用

 

2.2 各溶液配制方法与用量

2.2.1 CVF储存液配制（100 U/mL）

· 取材：从−80°C取出苏州丰度蛋白CVF冻干粉（按包装标定活性，如100 U/支）。

· 瞬时离心：离心机10,000×g离心30 s，使冻干粉沉积于管底。

· 复溶：在超净台内，加入1.0 mL含有0.1%极低内毒素BSA的无菌PBS（pH 7.4）。

· 溶解：置于冰上轻柔颠倒混匀（严禁剧烈涡旋，防止蛋白变性），静置10 min至完全溶解。

· 分装与保存：按20 μL/管（每管2 U）分装于低吸附EP管中，−80°C避光保存。有效期12个月，严禁反复冻融。

2.2.2 CVF工作液（体外实验）

· 配制：实验前取出一管储存液（100 U/mL），用含0.1% BSA的无菌PBS稀释至80 U/mL、120 U/mL、200 U/mL。

· 计算：按体系中CVF与血清体积比1:9加入，使血清终浓度分别达到8 U/mL、12 U/mL、20 U/mL。

2.2.3 CVF注射液（体内实验）

· 剂量标准：小鼠：20–50 μg/只（相当于10–20 U/只，按体重大致为0.5–1.0 U/g）；大鼠：60–100 U/kg体重。

· 稀释：取CVF储存液，用无菌0.1% BSA/PBS稀释。小鼠单次腹腔注射（i.p.）体积控制在100–200 μL/只。现配现用。

2.2.4 5×GVB²⁺储存液及1×GVB²⁺工作液

· 5×储备液：溶解41.5 g NaCl、5.1 g巴比妥钠、2.875 g巴比妥酸于800 mL超纯水中；另称取0.83 g CaCl₂·2H₂O和2.54 g MgCl₂·6H₂O溶解后混合，定容至1000 mL。

· 1×GVB²⁺工作液：现配200 mL：取40 mL 5×储备液，加入0.2 g明胶，加热至50°C完全溶解；冷却至室温，用超纯水定容至200 mL；用0.1 M HCl或NaOH精确调节pH至7.35±0.05。4°C保存，3天内用完。

2.2.5 0.1 M EDTA-GVB终止液

取无二价离子的GVB缓冲液（不含Ca²⁺/Mg²⁺），加入EDTA-2Na至终浓度0.1 M，调节pH至7.4。

2.2.6 2%致敏绵羊红细胞（SRBC）悬液

· 取压积SRBC，用预冷的1×GVB²⁺离心洗涤（800×g, 4°C, 5 min）至少3次，直至上清无色透明。

· 用1×GVB²⁺重悬沉淀，调整细胞浓度至约1×10⁹ cells/mL。

· 加入适量亚溶血剂量的兔抗SRBC溶血素（IgM，按试剂说明书标定比例），37°C水浴摇育30 min进行致敏。

· 洗涤2次后，用1×GVB²⁺重悬并定容为2%（体积比）悬液。541 nm处完全溶血OD值应在0.6–0.7之间。4°C储存，48小时内有效。

三、仪器与耗材

3.1 实验仪器

· 酶标仪（配备541 nm或540 nm滤光片）。

· 台式高速冷冻离心机（含微孔板转头及1.5 mL管转头）。

· 37°C恒温水浴箱 / 恒温摇床。

· 超净工作台（Class II型）。

· −80°C超低温冰箱与4°C医用保存箱。

3.2 耗材清单

· 96孔U型底微孔板（溶血反应专用）；96孔平底微孔板（酶标仪读数用）。

· 1.5 mL低吸附EP管（无DNase/RNase/内毒素）。

· 0.22 μm低蛋白结合水系针头滤器。

· 1.0 mL无菌注射器，小鼠配合31G针头。

· 毛细采血管、离心促凝管（用于小鼠眼眶/尾静脉采血）。

四、实验操作步骤

4.1 体外血清补体消耗实验（A线）

4.1.1 血清样品准备

· 从−80°C取出待测血清（正常人、小鼠或大鼠血清），置于冰水混合物中解冻。注意：血清绝不能热灭活（除非作为无补体阴性对照）。

· 4°C, 10,000×g离心5 min，吸取上清，去除不溶性脂质与蛋白沉淀。

4.1.2 反应体系构建与梯度设置

按下表在1.5 mL低吸附EP管中配置反应体系：

 

4.1.3 孵育与终止

· 轻柔弹击管壁混匀，置于37°C水浴箱中温育45 min。

· 取出后立即置于冰浴中孵育10 min以终止转化酶后续反应。

· 4°C, 12,000×g离心3 min。吸取上清分装，立即用于4.2节CH50测定，或快速冻存于−80°C。

4.2 CH50溶血活性测定（效果验证核心步骤）

CH50（50% Hemolytic Complement Activity）是指引起50%致敏绵羊红细胞发生溶血所需的血清最小量或最大稀释倍数。

4.2.1 血清梯度稀释（96孔U型板）

· 用1×GVB²⁺缓冲液将上述各组处理后的血清进行初始稀释（例如小鼠血清按1:10稀释；人血清按1:20稀释）。

· 在96孔U型板中，按倍比稀释法（1:2递增）设置8个稀释梯度，每孔最终保留50 μL稀释后的血清。

4.2.2 对照组设置

· 100%全溶血对照（A100）：50 μL蒸馏水 + 50 μL 2% SRBC。

· 0%溶血背景对照（A0）：50 μL 0.1 M EDTA-GVB + 50 μL 2% SRBC。

· 血清本底对照：50 μL稀释血清 + 50 μL GVB²⁺（无SRBC）。

4.2.3 溶血反应与读数

· 向各实验孔中均加入50 μL 2%致敏SRBC悬液，混匀（总反应体积为100 μL）。

· 将U型微孔板置于37°C恒温摇床中，300 rpm震荡温育60 min。

· 温育结束后，微孔板立即放入预冷离心机，4°C, 1500×g离心5 min，使未溶血的红细胞沉降至孔底。

· 用多通道移液器小心吸取上清液60 μL，转移至新的96孔平底板中。

· 酶标仪波长设定为541 nm，测定各孔吸光度（OD值）。

4.3 体内小鼠脱补体模型（B线）

4.3.1 实验动物选择与分组

· 动物标准：C57BL/6J或BALB/c小鼠，雄性，8–10周龄，体重22–25 g，无特定病原体（SPF级）。

分组（每组n≥6）：无处理对照组（PBS组）；CVF单次给药组；CVF维持给药组（追加半剂量）。

4.3.2 采血基线（Day 0, 0 h）

在给药前，通过尾静脉剪尾或眼眶静脉丛采集30 μL全血。置于室温30 min促凝，4°C, 3000×g离心10 min，分离血清作为0 h基线对照（Baseline）。

4.3.3 CVF给药方案

· 首剂注射：腹腔注射（i.p.）苏州丰度蛋白CVF注射液，剂量为20 μg/只（按25 g体重计算约为0.8 μg/g或0.6–0.8 U/g），注射体积为150 μL/只。注射须缓慢，防止瞬间过量引发过敏性休克。

· 追加维持：针对需维持脱补体>72 h的实验：首剂注射后第3天（72 h），按首剂的50%剂量（10 μg/只）补充腹腔注射一次。

4.3.4 动态采样时间线

分别于给药后1 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h进行尾静脉小量采血（每次20–30 μL全血），按4.3.2法分离血清，−80°C冻存。

4.3.5 终点检测

· CH50动态曲线测定：参照4.2节方法评估不同时间点的残余溶血活性。

· C3表达量定量：采用苏州丰度蛋白小鼠C3 ELISA试剂盒进行血清C3绝对浓度夹心法测定。

五、数据处理与数学公式

5.1 CH50溶血活性计算（von Krogh法）

对于每个血清样品，首先计算各个稀释度下的溶血百分率(y)：

溶血百分率与von Krogh线性拟合

y = (Asample − A0) / (A100 − A0)

其中 Asample: 待测血清孔吸光度
     A0: 0%溶血背景孔吸光度
     A100: 100%全溶血孔吸光度

von Krogh方程: log x = log CH50 + (1/n)·log[y/(1−y)]
取 y∈0.2–0.8 的3–5个点, 以 log[y/(1−y)]=X 为横坐标,
log x=Y 为纵坐标回归: Y = kX + b
当 y=0.5 时 X=0, 故 Y=b=log x50, 即 x50 = 10^b

CH50 (U/mL) = 1 / x50(mL) × 初始稀释倍数

5.2 血清C3剩余百分比（C3残余率）计算

基于ELISA测定的绝对C3浓度（μg/mL）：

C3残余率(%) = C(Time t) / C(Baseline 0 h) × 100%

脱补体模型成功标准：

· 体外处理（A线）：高剂量CVF组CH50降低至对照组的<5%。

· 体内小鼠（B线）：CVF注射后6–48 h内，血清CH50及C3浓度均降至基线值的<5%（视为构建完全脱补体模型）。

六、注意事项与关键控制点

· CVF剂量单位转换规范：CVF活性以单位（U）为第一评估标准，不同批次蛋白重组/提取的比活（U/mg）可能略有差异。严格禁止仅按质量（μg）而不顾活性单位（U）进行跨批次换算。每次换批次需参照苏州丰度蛋白随货提供的COA（质检报告）。

· 低温全流程操作：补体极其热不稳定，在室温下易自发失活。除特定37°C水浴孵育步骤外，血清分装、稀释、加样全过程必须在冰浴或4°C显微冷台上操作。

· 低吸附耗材与蛋白丢失：CVF在极低浓度下极易吸附于普通聚丙烯（PP）管壁。配制和储存工作液时，必须使用分析级低吸附EP管，且稀释液中必须含有0.1% BSA作为封闭载体蛋白。

· 红细胞（SRBC）质量控制：SRBC易发生自溶。致敏后的2% SRBC悬液应在4°C保存并在48 h内用完。若背景孔（0%溶血A0）的OD541值超过0.08，说明红细胞已自溶破裂，须重新洗涤或更换红细胞。

· 动物过敏性休克防范：CVF注入体内后迅速产生大量C3a/C5a（过敏毒素），可能引发小鼠瞬时血压下降或休克。注射速度需缓慢；给药后30 min内须密切观察小鼠状态，保持动物房环境温暖（建议使用加热垫）。

· 采血抗凝剂干扰：检测补体CH50活性或C3 ELISA时，采血严禁使用EDTA或高浓度肝素抗凝（EDTA会螯合Ca²⁺/Mg²⁺导致补体在测试中无法激活）。体内实验采血须使用无抗凝促凝管分离血清。

七、常见问题与排查指南（Troubleshooting）

 

八、附录

附录A：试剂配制速查表

 

附录B：CH50 von Krogh法计算示例

1. 原始吸光度数据（A541）：A100（100%全溶血，蒸馏水）= 0.650；A0（0%背景，EDTA-GVB）= 0.030；有效光吸收范畴 A100 − A0 = 0.620。

 

2. 回归计算：取稀释度1:80、1:160、1:320三点进行线性拟合：X=[+0.477, 0.000, −0.477]；Y=[−0.204, −0.505, −0.806]。拟合得直线方程Y = 0.631X − 0.505（相关系数R²=0.999）。

当y=0.5时X=0，则log x50 = −0.505，即x50 = 10^(−0.505) = 0.3126 μL = 0.0003126 mL。该血清的CH50活性为：CH50 = 1 / 0.0003126 mL ≈ 3200 U/mL。

附录C：不同种属CVF体内/体外参考剂量对照表