七、qPCR反应体系配制

7.1 单孔反应体系组成

标准推荐采用20 μL总反应体积（兼顾微量与移液容错率）：

 

注：引物浓度工作范围一般在0.1–0.5 μM，过高易诱发二聚体，过低导致平台期过早来临。

7.2 预混液（Master Mix）批量配制

为杜绝微量移液误差，绝对禁止直接在PCR反应孔内分装0.4 μL单个引物！必须按以下原则配制“鸡尾酒”预混物：

· 计算总孔数N，按 N+1 至 N+1.5 的冗余量配制大体系预混母液；

· 将Master Mix、上/下游引物、无酶水在无核酸污染区充分混合均匀；

· 每孔分装18 μL预混液至96孔板底，随后至样本添加区逐孔加入2 μL各自模板。

7.3 加样顺序与除气泡操作

· 加样顺序：先加无酶水 → 缓冲液 → 引物 → 模板；

· 加样时枪头悬空或紧贴孔壁微下段注入，严禁吹入微小气泡；

· 加样完毕盖上光学平盖或覆盖高透光学膜，利用专用刮板自中心向四周均匀刮压，确保每孔边缘完全密封；

· 将96孔板置于PCR板离心机中，2000 rpm离心1分钟，彻底甩落孔壁挂液并破除气泡（气泡会导致局部折射率剧变，引起荧光跳点）。

八、上机扩增程序设置

8.1 预变性（热启动酶激活）

· 程序：95℃，30秒 – 3分钟（根据酶化学修饰类型设定，抗体修饰热启动酶通常30–60秒，化学修饰酶需5–10分钟）。

· 目的：破坏DNA聚合酶的抗体螯合或化学封闭基团，释放酶活性；同时将双链cDNA彻底热变性变平直。

8.2 循环扩增阶段（两步法 vs 三步法）

两步法程序（推荐，高效便捷）：

· 变性：95℃，5–10秒；

· 退火/延伸：60℃，30–40秒（退火延伸一步完成，在此温度采集荧光）；

· 设置40个循环。

三步法程序（长片段或Tm差异较大时选用）：

· 变性：95℃，10秒；

· 退火：58℃，20秒；

· 延伸：72℃，20–30秒（在此阶段末采集荧光）；

· 设置40个循环。

8.3 荧光信号采集时点设置

必须在延伸阶段（Extension）的最后一步结束前点亮并保持荧光通道采集（Acquisition: ON）。严禁在95℃变性阶段开启信号采集。

8.4 熔解曲线程序（SYBR Green法必做）

紧跟40个扩增循环之后运行：

· 95℃，15秒（彻底解链）；

· 降温至60℃，维持1分钟（充分均匀复性形成完整dsDNA）；

· 以0.3–0.5℃/秒的步进连续升温至95℃，仪器全程高频持续采集荧光释放动力学数据。

8.5 仪器光学参数校正

根据所使用的仪器型号配置是否选择ROX通道校正（如ABI 7500/QuantStudio系列需要匹配High/Low ROX参比信号，Bio-Rad CFX系列则无需开启ROX）。

九、实验结果的初步判读

9.1 扩增曲线形态判断

正常的标准扩增曲线应呈现光滑平展的“S”型，并具有清晰的四个反应期：

· 基线期：Cycles 1–15，荧光信号被本底噪声覆盖，曲线水平平坦；

· 指数对数期：荧光以几何倍数持续激增，在半对数坐标系下呈高斜率直线，这是分析与截取Ct值的唯一黄金窗口；

· 线性期：扩增阻力增加，产物增速变缓；

· 平台期：底物消耗、荧光耗竭或产物自发抑制，荧光上升终止并呈现水平拉平。

荧光强度 (ΔRn)   ^
                  ---/---  异常：气溶胶污染/模板过浓（早起峰 Ct<10）
                 /
              正常S型      ---/--- 异常：抑制剂残留/效率极低（平缓直线）
             /--/        /
           /   /       /
         /    /      /
       --/   /     /
      /     /    /
+----+-----+------------------> 循环数 (Cycles)

9.2 熔解曲线分析

通过计算荧光对温度的一阶负导数（−dF/dT）绘制熔解峰：

· 优良指标：图谱中仅有单一窄峰（峰宽一般跨越2–4℃，半峰宽狭窄），表明全孔仅有单一靶向扩增子产物；

· 异常指标：在低温度段（65–75℃）出现矮宽杂峰：存在引物二聚体（Primer Dimer）；

· 在主峰周围存在双峰或多峰：引物特异性极差，发生了非特异扩增；

· 峰形严重前移或宽展：体系盐离子强度不匹配或序列突变。

−dF/dT   ^           正常：单一致密尖峰（单一扩增子）
         |              |
         |             / \
         |            /   \      异常：非特异双峰（特异性差）
         |           /     \       /\
         | 二聚体峰 /       \     /  \
         |   /\   /         \   /    \
         |  /  \ /           \ /      \
         +-----+--+-------------+----+------> 温度 (Tm)
                 70℃  75℃       85℃   90℃

9.3 对照孔的有效性判断

· NTC孔：无任何扩增曲线，或即便有扩增反应，其Ct值必须 ≥38且与样品Ct差值 ≥10，且熔解峰Tm值明显低于主产物（表明仅为微弱引物自聚）；若NTC出现与样本一致的典型S型曲线和单峰，证明试剂或水受气溶胶严重污染，整个批次数据作废！

· -RT孔：信号必须平展，证实无基因组DNA假阳性干扰。

9.4 Ct值导出

将荧光阈值线调整在各反应指数扩增期的重合直线段内（通常高于基线最大噪音信号的标准差10倍以上），确保所有平行技术重复孔的Ct离散度极小化。导出各孔原始Ct数据矩阵，进入统计运算。

十、数据分析（核心章节）

10.1 数据预处理

· 复孔离散度审查：计算每组3个技术重复孔的Ct均值和标准差（SD）。若其中一个孔与其他两孔差值 ΔCt > 0.5，且经查看由于气泡破裂或加样挂壁所致，可在记录后予以剔除，但至少保留2个有效技术重复；

· 求取均值：将合格技术重复的Ct值求算术平均数，代表该生物学样本的原始表达参数。

10.2 相对定量分析：2^−ΔΔCt法（Livak法）

本方法适用的强制前提：目的基因与内参基因的PCR扩增效率极为接近（差异在 ±5% 以内），且整体扩增效率 E ≈ 100%。

计算流程步骤：

· 步骤一（内参校正）：计算每个样本内，目的基因与内参基因的Ct差值（ΔCt）：

ΔCt_样本 = Ct_目的基因 − Ct_内参基因

注：ΔCt反映的是目的基因相对于自身内参的相对丰度，数值越大代表丰度越低。

· 步骤二（实验组与对照组校正）：选取对照组样本的ΔCt均值（ΔCt对照）作为校正基准，计算实验组和对照组各样本的差异值（ΔΔCt）：ΔΔCt = ΔCt处理组 − ΔCt对照。

· 步骤三（倍数计算）：计算实验组相对于对照组的相对基因表达倍数（Fold Change, FC）：

Fold Change = 2^−ΔΔCt

典型计算实例展示：

 

结果显示：处理组靶基因的转录水平较对照组上调了约4.07倍。

10.3 扩增效率校正法（Pfaffl法）

若预实验测得目的基因与内参基因的扩增效率存在差异，不能假定为2，必须利用Pfaffl数学模型校正实际扩增效率：

Ratio = (E目标)^{ΔCt目标(对照−处理)} / (E内参)^{ΔCt内参(对照−处理)}

· E_目标为目的基因扩增因子（如效率为95%，则E目标 = 1 + 0.95 = 1.95）；

· E_内参为内参基因扩增因子；

· ΔCt目标(对照−处理) = Ct_{目标,对照} − Ct_{目标,处理}。

10.4 绝对定量分析流程

· 建立标准曲线：配制已知拷贝数的纯化质粒（通常10倍梯度稀释 10⁷→10² 拷贝/μL）；

· 上机扩增并由软件自动拟合标准方程：

Ct = −k·log₁₀(Copy) + b；

· 代入待测未知样本的实测 Ct_sample，解方程求得样本分子的绝对拷贝数：log₁₀(Copy_sample) = (b − Ct_sample)/k ⟹ Copy_sample = 10^((b−Ct_sample)/k)；

· 结合取样体积与提取稀释因子，换算为单位组织重（copies/mg）或单位体积（copies/mL）的原样载量。

10.5 统计学分析规范

· 集中趋势与离散度：对生物学独立重复的2^−ΔΔCt表达倍数求算术平均值（Mean）及标准误差（Standard Error of the Mean, SEM）或标准差（SD）；

· 显著性检验：两组间比较采用两独立样本Student′s t检验（需先经过F检验验证方差齐性）；

· 三组及以上多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）配合事后检验（Post hoc test，如Tukey′s或Dunnett′s检验）；

· 显著性符号规范：* P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001；ns表示差异无统计学意义。

10.6 结果可视化呈现

数据绘图建议采用柱状散点图（Bar chart with individual points），完整呈现每个独立生物学重复的真实分布位点，避免信息压缩隐藏。必须标明误差棒代表SD还是SEM。对于大量基因的筛选实验，可将ΔΔCt转换为Z-score绘制分级聚类表达热图（Heatmap）。

十一、常见问题与Troubleshooting（故障诊断排查表）