溶液和试剂
裂解缓冲液
这些缓冲液可在4 ℃下保存数周，或者以分装形式在-20 ℃下保存长达1年。
Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液（适用于提取可溶性胞质蛋白，对膜蛋白破坏小；不适合强疏水性膜蛋白提取）
150 mM NaCl
1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代）
50 mM Tris-HCl pH 8.0
RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）（适用于提取总蛋白：胶质+部分核蛋白，裂解能力强；含脱氧胆酸钠，可能影响某些抗体结合，膜蛋白提取需谨慎）
150 mM NaCl
1.0% NP-40 或 0.1% Triton X-100
0.5% 脱氧胆酸钠
0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）
50 mM Tris-HCl pH 8.0
Tris-HCl 缓冲液（适用于提取温和条件下的可溶性蛋白：如酶活性蛋白；需配合蛋白酶 / 磷酸酶抑制剂，避免蛋白降解或去修饰）
20 mM Tris-HCl pH 7.5
注：一定要添加蛋白酶抑制剂；如检测磷酸化蛋白时，在原有蛋白酶抑制剂基础上，添加 1mM Na₃VO₄（酪氨酸磷酸酶抑制剂）+50mM NaF（丝氨酸 / 苏氨酸磷酸酶抑制剂），或直接使用 “蛋白酶 + 磷酸酶抑制剂鸡尾酒”。
电泳、转膜、封闭缓冲液
Laemmli 2×缓冲液/上样缓冲液
4% SDS
10% 2-巯基乙醇
20% 甘油
0.004% 溴酚蓝
0.125 M Tris-HCl
测定 pH 并调节至 pH 6.8。
电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS）
25 mM Tris 碱
190 mM 甘氨酸
0.1% SDS
测定 pH ，pH 应为约 8.3。必要时进行调节。
转膜缓冲液（湿转）
25 mM Tris 碱
190 mM 甘氨酸
20% 甲醇
测定 pH ，pH 应为约 8.3。必要时进行调节。
对于大于 80 kDa 的蛋白质，推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。
湿转缓冲液补充膜类型与分子量适配细节：
转 PVDF 膜：必须用 100% 甲醇活化 1min（激活膜上羟基，增强蛋白结合），转膜后用 TBST 洗去残留甲醇；
转 NC 膜：无需甲醇活化，直接用转膜缓冲液浸泡；
小分子量蛋白（<20kDa）：将甲醇浓度降至 10%-15%（减少蛋白变性），选用 0.2μm 孔径膜，转膜时间缩短 10%-20%。
转膜缓冲液（半干转）
48 mM Tris
39 mM 甘氨酸
10-15% 甲醇
0.04% SDS
“半干转时需用厚滤纸（如 Whatman 3MM），且胶 - 膜 - 滤纸组合无气泡”
封闭缓冲液
5% 奶粉（推荐使用，也可以用 BSA 牛血清白蛋白）
加入 TBST 缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。（称取奶粉后加入 TBST，室温磁力搅拌 30min 至完全溶解，期间避免剧烈搅拌产生气泡，溶解后立即用 0.45μm 滤膜过滤，现配现用）
封闭液选择原则：
- 常规抗体（非磷酸化、多克隆抗体）：5% 脱脂奶粉（成本低，封闭效果好）；
- 磷酸化抗体、单克隆抗体、标签抗体（如 His、Myc）：3% BSA（避免奶粉中磷酸蛋白 / 杂蛋白与抗体交叉反应）；
- 所有封闭液均需用 0.45μm 滤膜过滤，去除微小颗粒，减少背景斑点。
实验步骤
样品裂解
- 制备细胞培养物裂解物
1) 将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
2) 吸出PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每107 细胞/100mm培养皿/150 cm2 培养瓶加入1 ml；每5 × 106细胞/60mm 培养皿/75 cm2 培养瓶加入0.5 ml）。
3) 用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。
4) 在4℃下持续搅拌30 分钟。随后进行超声处理，以VirTis 探头超声仪为例，超声条件是：输出电功率是 30%－40% ，10-15s ，3次(期间每次间隔15s)，大约电流 30A；如果没有超声仪，请用带注射器的针头(20G-18G-16G)冰上反复抽吸，直到裂解液澄清；
5) 在4 ℃预冷的离心机中以16,000 ×g 的转速离心 20 分钟。
6) 轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。
- 制备组织裂解物
组织裂解步骤：
硬组织（如肝脏、肌肉）：先将组织块置于液氮中研磨成细粉末
（避免反复冻融），再加入预冷裂解液；
软组织（如脂肪、脑组织）：直接用电动匀浆器（转速 10000-15000rpm）匀浆，每匀浆 30s 暂停 10s（防止产热导致蛋白变性），共 3-5 次，直至无明显组织块；
所有裂解液加入后，4℃回旋振荡 2h（振荡频率 150-200rpm），确保蛋白充分释放。
1) 用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。
2) 将组织置于圆底微量离心管或 Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在 -80 ℃ 下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。对于约 5 mg 的组织，向离心管中快速加入约 300 μL 裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆，用另外 300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在 4 ℃ 下持续搅拌（例如，在回旋振荡器上）2小时。随后进行超声处理，以 VirTis 探头超声仪为例，超声条件是：输出电功率是 30%-40% ，10-15s ，3 次(期间每次间隔 15s)，大约电流 30A；如果没有超声仪，请用带注射器的针头(20G-18G-16G)冰上反复抽吸，直到裂解液澄清；
3) 4 ℃ 下在微型离心机中以 16,000 × g 离心 20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。
· 膜蛋白提取：使用试剂盒时，需严格按照 “裂解-离心（10000×g，10min）-收集上清（胞质）-沉淀用膜蛋白裂解液重悬-超声（功率 30%，10s×3 次）”步骤，避免胞质蛋白污染；
· 核蛋白提取：裂解后需经过“低渗缓冲液处理-离心去胞质-核裂解液裂解-超声”，最后离心（16000×g，20min）收集核蛋白上清，避免核膜碎片残留。
样品制备
- 取出小部分 (50 μL) 裂解物，用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。
蛋白定量标准步骤（以常用 BCA 法为例）：
A.制备 BSA 标准品（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL），各取 25μL 加入 96 孔板；
B.样品稀释（裂解液可能干扰检测，建议用 PBS 稀释 5-10 倍），取 25μL 加入孔中；
C.每孔加 200μL BCA 工作液（A 液：B 液 = 50:1），37℃孵育 30min，562nm 处测吸光度，计算蛋白浓度；
D.根据浓度调整上样体积，确保每孔上样量一致（20-30μg 总蛋白）。
2.向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的 2× Laemmli 样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
3.还原和变性：常规蛋白在100 ℃ 下将样品缓冲液中的每种细胞裂解物煮沸 5 分钟，并进行分装。热敏性蛋白：70℃孵育 10min（避免高温导致蛋白沉淀），同时确保上样缓冲液中 2 - 巯基乙醇浓度充足（维持变性状态）。在 -20 °C 下保存裂解物。
注意：分装细胞裂解物 (50 - 100 μL)，避免反复冻融循环。
4. 在 37 ℃ 下解冻装有细胞裂解物的离心管。在微型离心机中以 16,000 × g 离心 5分钟。
上样和电泳
1. 将等量的蛋白质和分子量标准上样到 SDS-PAGE 凝胶孔中。来源于细胞裂解物或组织匀浆的总蛋白的上样量为 20 - 30 μg，纯化蛋白的上样量为10 - 100 ng。
2. 在 100 V 下电泳 1 至 2 小时。需要根据蛋白大小、仪器等条件对时间和电压进行一些优化。
电泳条件优化表：
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凝胶浓度 |
适用蛋白分子量范围 |
电压设置 |
预计电泳时间 |
终止判断标准 |
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8% |
100-250kDa |
80-90V |
2.5-3h |
溴酚蓝跑至凝胶底部 1cm 处 |
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10% |
50-150kDa |
90-100V |
1.5-2h |
溴酚蓝跑至凝胶底部 1.5cm 处 |
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12% |
20-80kDa |
100-110V |
1-1.5h |
溴酚蓝跑至凝胶底部 2cm 处 |
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15% |
<30kDa |
110-120V |
0.5-1h |
溴酚蓝跑至凝胶底部 2.5cm 处 |
内参选择对应关系：
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蛋白定位 |
推荐内参蛋白 |
注意事项 |
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胞质蛋白 |
GAPDH、β-actin |
避免在脂肪组织中用 GAPDH（脂肪细胞中表达低） |
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核蛋白 |
Lamin B1、Histone H3 |
需用核蛋白提取试剂盒，避免胞质污染 |
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膜蛋白 |
Na+/K+-ATP 酶、Calnexin |
需用膜蛋白提取试剂盒，确保蛋白完整性 |
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总蛋白 |
β-actin、Tubulin |
适用于大多数细胞 / 组织，避免在高分化组织（如肌肉）中用 Tubulin |
将蛋白质从凝胶转移到膜上
膜可以是硝酸纤维素或 PVDF，两者各具优点。用甲醇“活化”PVDF 1 分钟，并在制备堆叠体之前用转膜缓冲液冲洗 PVDF 。（可能需要对时间和电压进行一些优化。）
湿转条件量化表（以 0.45μm PVDF 膜为例）：
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蛋白分子量 |
恒流设置 |
转膜时间 |
额外措施 |
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<50kDa |
150-200mA |
30-60min |
转膜槽外贴冰袋（防发热） |
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50-100kDa |
200-250mA |
60-90min |
凝胶与膜之间用滤纸紧密贴合，无气泡 |
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100-200kDa |
250-300mA |
90-120min |
缓冲液中加 0.1% SDS，提升转膜效率 |
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>200kDa |
300-350mA |
120-180min |
用低浓度胶（6%-8%），转膜时持续冰浴 |
抗体染色
1. 用 5% 封闭溶液在室温下封闭膜 1 小时，或在 4 ℃ 下封闭过夜。
2. 抗体孵育条件：一抗稀释：首次使用时，用封闭液配制 1:500、1:1000、1:2000 三个梯度，分别孵育膜，通过结果筛选最优稀释比例；
孵育方式：4℃过夜孵育时，需在回旋振荡器上缓慢振荡（50-80rpm），确保抗体均匀结合；室温孵育时，需密封孵育盒（避免蒸发导致抗体浓缩）。
3. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
4. 用推荐稀释度的标记二抗在含 5% 封闭缓冲液的 TBST 中室温孵育膜 1 小时。
5. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟，然后用 TBS 冲洗。
6. 移除多余的试剂，利用暗室显影技术采集化学发光图像，或利用常规图像扫描法采集比色检测图像。
关于信号检测：
ECL 发光液选择：常规蛋白用普通 ECL，低表达蛋白用超敏 ECL；
曝光操作：先进行预曝光（10s、30s、1min），根据条带亮度调整曝光时间（避免过度曝光导致条带饱和）；
膜回收：若需检测内参或其他蛋白，曝光后用 stripping buffer洗脱一抗，再重新孵育新抗体（避免重新制样）。
丽春红染色步骤：
转膜结束后，将膜放入1×丽春红染液中，室温振荡5-10min（至条带清晰可见）；
用TBST室温振荡洗涤3次，每次2min（洗去残留染液，避免背景）；
拍照记录Marker条带位置（判断转膜是否成功），随后立即进行封闭（避免膜干燥）。
