一、实验原理

qPCR 技术是在传统 PCR 反应体系中引入荧光化学物质，利用荧光信号的实时积累监控 PCR 进程，并对初始模板进行定量分析。

1.1 嵌合染料法（SYBR Green I）化学原理

SYBR Green I 是一种特异性结合双链 DNA（dsDNA）小沟槽的荧光染料。

· 游离状态：染料发出的荧光信号极弱。

· 结合状态：当染料与扩增产生的 dsDNA 结合时，其荧光信号增加数百倍。随着 PCR 循环的进行，产物不断积累，荧光信号强度与 dsDNA 数量呈正比。

1.2 动力学曲线与定量逻辑

· 基线（Baseline）：PCR 早期（通常为第 3–15 循环）荧光信号变化平缓的区域。

· 荧光阈值（Threshold）：设定在指数扩增期的荧光信号强度线，通常为基线荧光信号标准差的 10 倍。

· 阈值循环数（CT 值）：扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数。模板起始拷贝数的对数值与 CT 值呈严格的反比线性关系。

· ROX 被动校准：体系中加入 ROX 染料作为被动参考信号，通过计算归一化荧光值 Rn = FTarget/FROX，消除液面蒸发、管壁折射及光路微小偏差带来的干扰。

二、实验前期准备

2.1 实验室分区与气溶胶控制

为避免扩增产物（Amplicons）造成假阳性污染，必须严格区分：

· 试剂配制区（无模板区）：配制 Master Mix，严禁接触核酸模板。

· 模板制备区：进行 DNA/cDNA 模板的加样与稀释。

· 扩增与分析区：放置 qPCR 仪器，进行扩增与数据分析。

实验前，台面与移液器需用核酸清除剂擦拭，并开启紫外灯（254 nm）照射 30–60 min。

2.2 模板质量控制

· DNA/cDNA 纯度：超微量分光光度计检测，A260/A280 应在 1.8–2.0（DNA）或 1.8–2.1（cDNA）；A260/A230 应 > 2.0，无异硫氰酸胍、酚或盐类残留。

· 模板输入量：单孔建议 DNA 输入量 < 100 ng，cDNA 输入量相当于 1 pg–100 ng 的总 RNA 转录物，避免浓度过高抑制 PCR 反应。

2.3 热力学引物设计规范

· 产物长度：80–150 bp（最佳），最长不超过 200 bp。

· 退火温度（Tm）：59.0℃–61.0℃（上下游引物 Tm 差值 < 1.0℃）。

· GC 含量：40%–60%。

· 结构避免：避免 3′ 端连续 3 个以上的 G/C 碱基；避免形成发夹结构或引物二聚体（3′ 端自由能 ΔG > −6.0 kcal/mol）。

三、实验耗材与试剂

为保证反应体系的高适配性，全部核心试剂与耗材均推荐采用丰度蛋白自主研发的产品：

3.1 核心试剂（丰度蛋白系列）

· qPCR 预混液：丰度® 2× Universal SYBR Green qPCR Master Mix。含抗体法封闭的丰度® Hot-Start Taq DNA 聚合酶、Mg²⁺（2.5 mM）、dNTPs Mix（200 μM each）、SYBR Green I 及通用型 ROX。

· 模板准备试剂：丰度® 高纯 gDNA 提取试剂盒 / 丰度® cDNA 第一链合成试剂盒。

· 稀释与反应介质：丰度® Nuclease-Free Water。

3.2 低吸附无核酸酶耗材

· 丰度® RNase/DNase-Free 滤芯吸头：疏水性 PP 材质，低吸附，防气溶胶污染。

· 丰度® 0.2 mL Quantitative PCR 8 连管 / 96 孔无酶荧光定量 PCR 板及高透光学封板膜：保证光穿透率 > 98%，管间热传导误差 < 0.1℃。

四、实验注意事项

· 防避光与冻融：丰度® 2× Universal SYBR Green qPCR Master Mix 含有光敏染料，配制过程需避光。解冻后须颠倒混匀，离心后使用，避免反复冻融（≤ 5 次）。

· 消除气泡：96 孔板加样后，孔底不得存在气泡，否则会严重干扰光路采集，导致扩增曲线异常波动。

· 复孔设置：实验必须设置至少 3 个技术复孔（Technical Replicates），同一样品复孔间的 CT 值标准差（SD）应 < 0.2。

对照设置（MIQE 规范）

· NTC（无模板对照）：验证试剂与环境是否存在污染或引物二聚体。

· NRT（无反转录对照）：验证是否存在 gDNA 污染（仅对 RT-qPCR）。

五、实验体系配置

在无模板区配制以下反应体系（以 20 μL 总体积为例）：

六、实验过程与步骤

步骤一：试剂准备与配制

· 将“丰度® 2× Universal SYBR Green qPCR Master Mix”、引物及丰度® Nuclease-Free Water 解冻，冰上放置。

· 涡旋震荡 5 秒混匀试剂，短暂离心将液体收集至管底。

· 根据 N（样品数 + 2 对照 + 1 损耗）计算总体积，配制预混 Master Mix。

步骤二：加样与封板

· 将 Master Mix 按每孔 18 μL 分装至丰度® 96 孔荧光定量 PCR 板中。

· 在模板区加入 2 μL 模板或 Nuclease-Free Water（NTC），总体积 20 μL。

· 覆盖丰度高透光学封板膜，使用刮板均匀压实，确保边缘无漏气。

步骤三：离心与上机

· 将 96 孔板放入离心机，于 1000 × g 离心 1 min，彻底消除孔底气泡并使液体沉降。

· 将 96 孔板放入实时荧光定量 PCR 仪，设置热循环程序。

步骤四：热循环程序设置（标准两步法）

热循环参数

· 95℃ 预变性 30 s（热启动酶激活）。

· 40 个循环：95℃ 变性 5 s → 60℃ 退火/延伸 30 s（荧光采集）。

· 熔解曲线：95℃ 15 s → 60℃ 1 min → 缓慢升温至 95℃，连续采集荧光。

七、数据处理、质量控制与计算方法

7.1 熔解曲线（Melt Curve）质量控制

扩增完成后分析 dF/dT 对温度的导数曲线：

· 单峰（Single Peak）：吸收峰狭窄且对称（峰宽 < 1.5℃），表明扩增产物单一，数据有效。

· 双峰或杂峰：若在 Tm < 80℃ 处出现小峰，通常为引物二聚体；若在主峰旁出现杂峰，提示存在非特异性扩增。

7.2 扩增效率（E）评估与标准曲线

对模板进行 5 个点（如 10 倍梯度）稀释，绘制 CT 值对 Log[浓度] 的标准曲线：

· 线性相关系数：R² ≥ 0.99。

· 标准曲线斜率（Slope）：须处于 −3.58 至 −3.10 之间。

扩增效率公式：

E = 10^(−1/Slope) − 1

合格的反应体系扩增效率 E 应在 90%–110%（对应斜率为 −3.322 时，E = 100%）。

7.3 相对定量计算（2−ΔΔCT 法）

在目标基因与内参基因扩增效率相近（差异 < 5%）时，采用 2−ΔΔCT 法：

计算 ΔCT：

ΔCT(实验组) = CT(目标基因,实验组) − CT(内参基因,实验组)

ΔCT(对照组) = CT(目标基因,对照组) − CT(内参基因,对照组)

计算 ΔΔCT：

ΔΔCT = ΔCT(实验组) − ΔCT(对照组)

计算表达倍数（Fold Change）：

Relative Expression = 2^(−ΔΔCT)

若扩增效率差异较大，应采用 Pfaffl 模型修正计算：

Ratio = (ETarget)^ΔCT,Target(对照-实验) / (ERef)^ΔCT,Ref(对照-实验)

八、总结

苏州丰度蛋白生物科技有限公司研发的 qPCR 全流程试剂与耗材体系，具有高扩增效率、高荧光信噪比及优异的管间重复性。

科研人员通过严格执行本 SOP 中的环境隔离、模板质控、引物优化、离心除气泡及熔解曲线验证，可有效杜绝非特异性扩增与污染，从而获取符合国际高水平学术发表要求的 qPCR 定量数据。