一、产品概述与分子机理

1.1 分子特征与功能定位

人 CD28（Cluster of Differentiation 28）是一种分子量约为 44 kDa 的同源二聚体 I 型跨膜糖蛋白，主要表达于约 95% 的人类 CD4⁺ T 细胞以及约 50% 的 CD8⁺ T 细胞表面。

Anti-Human CD28 mAb 是一种针对人源 CD28 胞外功能结构域的高度特异性单克隆抗体。该抗体通常采用小鼠来源（如 Mouse IgG1, κ）或经人源化重组工程改造生产，其亲和力常数（Kd）通常在纳摩尔级（10⁻⁹～10⁻⁸ M）。

1.2 体外生物学效应

在缺乏第一信号（未结合 Anti-CD3 或抗原刺激）的情况下，大部分非超激动型（Non-superagonistic）Anti-Human CD28 单抗（如经典克隆 CD28.2）单独作用于 T 细胞时表现为惰性或微弱信号，不引起非特异性全面自发活化；一旦与 Anti-CD3 mAb（如 OKT3 克隆）协同结合，即迅速诱导：

· 逆转免疫耐受：阻断 E3 泛素连接酶（如 Cbl-b）的负调控转录，避免 T 细胞陷入低反应状态。

· 重塑代谢通路：上调葡萄糖转运蛋白 GLUT1 的膜表面转位，促使 T 细胞代谢从氧化磷酸化向有氧糖酵解重编程，满足快速分裂的能量需求。

· 驱动生存表型：显著上调抑凋亡蛋白 Bcl-xL 的表达，使扩增活化的 T 细胞获得更长的体外存活周期及向中枢记忆型 T 细胞（TCM）或干细胞样记忆型 T 细胞（TSCM）分化的潜力。

1.3 苏州丰度蛋白生物的技术赋能

在体外免疫细胞生产体系中，抗体制剂中的宿主细胞杂质、内毒素（LPS）及聚集体会对细胞表型产生毒性并破坏分化平衡。苏州丰度蛋白生物有限公司推出的科研级与工业级 Anti-Human CD28 mAb 严格采用无血清悬浮 CHO/HEK293 表达体系，经亲和层析、分子筛（SEC）及特异性去内毒素色谱填料多级精制纯化：

· 超低内毒素控制：内毒素水平控制在 <0.1 EU/μg（经鲎试剂凝胶法/发色底物法严格复核），彻底规避由内毒素诱导的单核细胞异常过度活化。

· 超高单体纯度：高分辨率 SEC-HPLC 分析单体纯度 ≥98%，无异常高分子聚集体（Aggregation），保障抗原表位结合的一致性。

· 优良的功能无菌标准：经 0.22 μm 除菌过滤，不添加叠氮化钠（NaN₃）等可能引起细胞线粒体毒性的防腐剂，即开即用，高度适配临床前过继细胞治疗工艺验证。

二、实验耗材与试剂清单

为保证 T 细胞活化培养体系的高重复性，必须选用经严格质控的原料组分：

2.1 核心活性蛋白与抗体试剂

· Anti-Human CD28 mAb（规格推荐：1 mg/mL，苏州丰度蛋白生物有限公司提供，货号及批次经超低内毒素认证）；

· Anti-Human CD3 mAb（克隆号如 OKT3 或 UCHT1，功能级无叠氮钠，苏州丰度蛋白生物有限公司匹配提供）；

· 重组人白介素-2（Recombinant Human IL-2）（无菌工业级纯度，用于维持活化后 T 细胞的持续分裂）；

· 流式细胞术检测抗体：FITC-Anti-Human CD3、PE-Anti-Human CD69、APC-Anti-Human CD25、PerCP-Cy5.5-Anti-Human CD4、PE-Cy7-Anti-Human CD8（用于评估细胞活化动力学指标）。

2.2 基础培养基与支持试剂

· 无菌 Dulbecco's 磷酸盐缓冲液（DPBS，无钙镁离子，pH 7.2～7.4）；

· 人 PBMC 淋巴细胞分离液（密度梯度离心介质，密度 1.077 g/mL）；

· 基础培养基（如 RPMI-1640 或工业化化学成分明确的 T 细胞无血清培养基，如 X-VIVO 15 / TexMACS）；

· 细胞培养级胎牛血清（FBS，若使用含血清体系，需经 56°C 30分钟热灭活处理）或人类自身自体血浆/AB型血清；

· 活细胞计数试剂（台盼蓝染液或基于吖啶橙/碘化丙啶 AO/PI 的自动荧光计数仪试剂盒）。

2.3 实验耗材与仪器

· 组织培养级无处理或处理型 24 孔 / 48 孔 / 96 孔平底细胞培养板（若执行固相包被，建议选择未作亲水处理的高结合力悬浮培养板）；

· 0.22 μm 低蛋白吸附滤器（PES 材质）；

· 低吸附微量移液枪吸头、无菌无酶 15 mL/50 mL 离心管；

· 标准多色流式细胞仪（如 BD FACSCanto / CytoFLEX）；

· 恒温三气或双气细胞培养箱（设定 37°C，饱和湿度，5% CO₂）。

三、实验前准备工作与体系评估

3.1 供体细胞质量控制（Starting Material QC）

· 使用来自健康成年人外周血（外周血单核细胞，PBMC），提取分离后应在2小时内完成洗涤与铺板；

· 采用台盼蓝或 AO/PI 荧光染色评估初始细胞活力，细胞活率必须 ≥90%；若使用冻存 PBMC，复苏后建议在完全培养基中静置平衡 2–4 小时，去除死细胞碎片后再进行诱导活化。

3.2 抗体呈现模式策略选择（物理固相包被 vs. 可溶性游离添加）

不同的实验目的对应不同的抗体呈现方式，应在实验前做好方案决策：

方案 A：固相共包被法（Plate-bound Co-coating，金标准推荐）

将 Anti-CD3 mAb 与 Anti-Human CD28 mAb 共同包被在塑料聚苯乙烯孔板表面。机理：单体抗体在孔板表面高密度物理吸附后形成规则分子阵列，强制受体发生多聚化簇集（Clustering），强力模拟体内抗原呈递细胞形成的“免疫突触”（Immunological Synapse）。适用于纯化后的纯 T 细胞体系（缺失单核/树突状细胞等 APC 的体系）。

方案 B：可溶性悬浮法（Soluble Addition）

将 Anti-CD3 预先包被，而将 Anti-Human CD28 mAb 直接溶解于液体培养基中悬浮添加。机理：可溶性 Anti-CD28 往往依赖体系中微量存在的 APC 表面 Fc 受体（FcγR）进行空间锚定与二次交联。若体系为高度纯化的 T 细胞（如经磁珠阴选纯化纯度 >95% 的 T 细胞），单独可溶性添加可能导致共刺激信号交联度不足，影响增殖效率。

四、标准操作流程（SOP：以固相共包被法活化人PBMC中T细胞为例）

步骤 1：培养板表面抗体固相包被（前一日进行）

工作液配制：

· 取无菌 DPBS（pH 7.4），在无菌超净工作台中稀释抗体。

· 设定终浓度：Anti-Human CD3 mAb 通常推荐 1.0～2.0 μg/mL；苏州丰度蛋白生物提供的 Anti-Human CD28 mAb 推荐配制终浓度为 1.0～3.0 μg/mL（常规黄金配比为 1:1 或 1:2 质量比）。

铺板包被：

· 以 24 孔板为例，每孔加入配制好的双抗体混合液 300 μL（确保液体均匀铺满孔底，严禁产生气泡阻隔受热面）；若为 96 孔板，每孔加入 50～100 μL。

结合温育：

· 盖好板盖，密封孔隙防蒸发，置于 4°C 冰箱避光恒温孵育过夜（12–16小时）；亦可置于 37°C 细胞培养箱孵育 2–3 小时（为求蛋白分子排列平整均一，首选 4°C 过夜法）。

步骤 2：去除游离抗体与封闭（实验当日）

· 从 4°C 冰箱取出包被好的孔板，在生物安全柜内快速翻转弃去孔内抗体包被液（或用微量移液器吸净废液）；

· 每孔加入 500 μL 室温无菌 DPBS，轻柔洗涤孔底 2 次，彻底洗去未物理吸附的游离抗体分子；

· （可选）：为防止后续实验中由于非特异性蛋白吸附造成背景干扰，可加入含有 1% 无菌牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 在 37°C 封闭 30 分钟，并再次用 DPBS 洗涤一次。

步骤 3：原代 T 细胞接种与共刺激活化

细胞浓度调整：

· 采用无血清 T 细胞培养基（或含 10% 热灭活 FBS 的完全培养基）重悬 PBMC 或分离纯化后的 T 细胞，调整活细胞工作密度至 1.0×10⁶～2.0×10⁶ cells/mL。

细胞接种：

· 向包被并洗涤完毕的 24 孔板各孔中加入 1.0 mL 细胞悬液（即每孔接种约 1～2×10⁶ 个细胞）。

补充生长因子：

· 加入外源重组人白介素-2（rhIL-2），推荐初始刺激终浓度为 50～100 IU/mL（活化初期双抗自身即可驱动内源性 IL-2 分泌，但外源补充可进一步巩固抗凋亡表型）。

培养与诱导：

· 置于 37°C、5% CO₂ 恒温加湿培养箱中静置培养。接种后最初 48 小时内严禁剧烈震动、晃动或移出培养板，确保活化信号转导与免疫突触形成不受物理扰动。

步骤 4：动力学监控与扩增维持（第 48–72 小时）

显微镜下表型观察：

· 在培养至 24–48 小时，显微镜下应观察到大量细胞脱离孤立单分散状态，自发聚集形成肉眼可辨的致密“增殖葡萄串样细胞团簇”（Cell Clusters），此乃 T 细胞被成功激活的形态学特征；

表型活化标志物流式检测：

· 收集部分活化细胞进行荧光抗体标记检测：

· 早期活化标志物：培养 24 小时后，CD69 阳性表达率应迅速攀升至 >60%；

· 中晚期活化标志物：培养 48–72 小时后，高亲和力 IL-2 受体 α 链（CD25）表达水平应显著上调（阳性率通常 >70%）。

传代与脱离抗体刺激：

· 在持续刺激 48–72 小时后，T 细胞活化信号已充分建立。此时必须将细胞移出包被板，转移至未包被抗体的常规组织培养瓶（如 T75 / T175）中进行扩增传代；

· 随着细胞分裂，代谢产物加速累积（培养基呈变黄趋势），需每 1–2 天补加含 IL-2 的新鲜培养基，保持细胞密度在 0.5×10⁶～1.5×10⁶ cells/mL 之间。

五、整个实验过程中的全流程注意事项与排错指南

为了最大化保证抗体效能，规避因操作失误引起的细胞耗竭或无应答，必须在全生命周期内严格执行以下质控细则：

5.1 试剂保存与稳定性维护

· 冻融频次控制：Anti-Human CD28 mAb 原液在未开封时建议置于 −20°C 至 −80°C 长期保存。开封后如无法一次性用尽，必须按单次实验用量在无菌超净台内严格分装（如 10～50 μL/管），避免反复冻融（≤2 次）。反复冻融会导致免疫球蛋白铰链区构象断裂及 Fc/Fab 段变性聚集。

· 物理振荡规避：含有单克隆抗体的液体极其脆弱，混匀时严禁剧烈高速涡旋（Vortex），否则易因空气-液体界面的剪切力引起抗体蛋白变性与不可逆沉淀。建议采用温和上下颠倒或指弹管壁混匀。

5.2 避免激活诱导的细胞死亡（AICD）与过度刺激

· 时间窗控制（脱板时机）：强烈的 TCR/CD28 持续交联虽然能赋予细胞极高的分裂潜能，但过长时间的持续刺激（包被板培养超过 5 天不脱板）会诱发 Fas/FasL 介导的“激活诱导细胞死亡”（Activation-Induced Cell Death, AICD），导致细胞大面积凋亡并过早走向衰老（Senescence）。因此，刺激 48–72 小时后脱板是维持细胞活力的关键阈值。

· 抗体浓度平衡：Anti-CD28 浓度的增加并非与刺激效应呈无限线性正相关。过高浓度的抗体反而会阻断有效受体交联（高亲和力抗体竞争结合导致钩状效应/Hook Effect）。建议在批量放大前，使用苏州丰度蛋白生物提供的质控标准品，在目标供体 PBMC 体系中执行 0.5、1.0、2.0 及 5.0 μg/mL 的浓度梯度预实验。

5.3 规避边缘效应与包被均一性保障

· 防止液体挥发：在 24 孔或 96 孔板包被温育过夜时，微量液体的边缘挥发会导致孔边缘抗体浓度人为升高，产生极其严重的微孔内信号不均一。建议在孔板最外围一圈的边缘孔内加入等体积的无菌灭菌水，保持孔板边缘微环境处于湿度饱和状态。

· 耗材材质选择：请勿使用经亲水涂层过度氧化的极高贴壁细胞专用板执行固相抗体包被，部分高贴壁涂层会干扰抗体分子的自然静电吸附物理构象。优先选用未经组织培养处理（Non-TC treated）的悬浮聚苯乙烯平底培养板。

六、总结与技术展望

在过继性免疫细胞疗法（ACT）向工业化、精细化快速推进的今天，精准重现生理级 T 细胞协同活化信号是所有体外生物工艺开发的起点。Anti-Human CD28 mAb 凭借其对于 CD28 跨膜受体的特异性结合能力，打破了宿主细胞耐受束缚，为 T 细胞的大规模功能性扩增赋予了生化动力。

作为专注于高标准重组蛋白与细胞治疗核心关键原材料研发的企业，苏州丰度蛋白生物有限公司始终立足于从分子构建、发酵纯化到生物活性评估的全流程质控。公司所提供的 Anti-Human CD28 mAb 凭借纯度高、内毒素含量低、亲和力强、批间差可控等物理生化特征，切实解决了科研人员在 T 细胞活化中面临的背景噪音高、细胞存活率低和结果难以重现的瓶颈。通过提供工业级关键试剂支持与专业的技术服务，苏州丰度蛋白生物将继续携手全球生命科学与生物医药研发人员，共同推动肿瘤免疫治疗与细胞药物开发的临床转化进程。