一、引言：为什么要讲传代

体外细胞培养（Cell Culture）是现代生物医学研究的基础技术之一。然而，体外环境无法像体内系统那样提供无限的微循环与空间。当细胞在培养容器中不断增殖、占据有限的空间并消耗营养成分时，必须通过细胞传代（Subculture / Passaging）来维持其生命活动。

所谓细胞传代，是指将培养达到一定密度的细胞从原培养容器中取出，进行稀释后接种到新的培养容器中继续培养的过程。

传代不仅是简单的“换地方生长”，它是细胞培养中的核心生命线：

决定细胞的生长状态：操作得当可维持细胞在对数生长期；消化过度或接种过稀则会导致细胞损伤甚至死亡。

决定实验的可重复性：规范的传代能维持细胞系基因与表型的稳定性；不当的传代则会加速细胞老化、突变或分化。

二、传代的科学基础（原理篇）

2.1 细胞体外生长的生命周期

贴壁或悬浮细胞在接种到新的培养容器后，通常表现出典型的 S 型生长曲线，分为四个阶段：

潜伏期 / 适应期（Lag Phase）：细胞贴壁、伸展，修复消化过程中的受损受体，合成新蛋白质，细胞数量无明显增加。

对数生长期（Log Phase）：细胞呈指数级分裂增殖，活性最强，代谢旺盛，此阶段是进行传代和实验的最佳时期。

平台期 / 平顶期（Stationary / Plateau Phase）：细胞密度过高，空间与营养受限，增殖速率与死亡速率平衡，总细胞数不再增加。

衰亡期（Death Phase）：营养耗尽、代谢毒素积累，细胞开始大量死亡、脱落。

2.2 为什么需要传代

当细胞进入平台期，以下因素会急剧恶化其生存环境：

营养耗尽：培养基中的葡萄糖、氨基酸（如谷氨酰胺）及生长因子被大量消耗。

代谢废物积累：乳酸（Lactic acid）和氨（Ammonia）的积累导致培养基 pH 显著下降（酚红变黄），产生细胞毒性。

物理空间受限：细胞彼此挤压，无法继续扩展。

2.3 接触抑制（Contact Inhibition）

正常贴壁细胞（如成纤维细胞、上皮细胞）具有接触抑制特性。当细胞互相碰撞并铺满培养表面时，细胞间的连接信号（如钙粘蛋白 Cadherin）会传导阻断信号，使细胞周期停止在 G1 期，暂停分裂。

注意：连续肿瘤细胞系或转化细胞系（如 HeLa、293T）通常部分或完全丧失了接触抑制能力，可以重叠堆积生长。但过度堆积仍会导致底层细胞因缺氧和缺乏营养而坏死脱落。

2.4 贴壁细胞与悬浮细胞的本质区别

贴壁细胞与悬浮细胞的本质区别

三、传代的时机判断（关键第一步）

判断何时传代是细胞培养的基本功，过早或过晚传代都会对细胞造成不可逆的损害。

3.1 汇合度（Confluence）的概念

汇合度（Confluence / 融合度）是指在倒置显微镜视角下，贴壁细胞所覆盖培养容器底面积的百分比。

汇合度示意：约 30% 汇合度对应接种初期，细胞稀疏分散、未达传代时机；约 80% 汇合度对应最佳传代窗口期，细胞覆盖大部分培养面且仍处对数生长期；100% 汇合度对应过度融合，细胞已铺满培养面，面临衰老与分化风险。

3.2 最佳传代时机

通用黄金标准：细胞处于对数生长期，汇合度达到 70%–80%（部分生长快速的肿瘤细胞系可放宽至 85%–90%）。

悬浮细胞标准：通过细胞计数与培养基颜色判定，当细胞密度达到 1×10⁶～2×10⁶ cells/mL 且培养基开始变黄时传代。

3.3 传代时机偏差的后果

传代过早（汇合度 < 50%）：细胞间旁分泌生长因子浓度不足；潜伏期显著延长，生长缓慢；胰酶消化损伤占比相对过高；部分脆弱细胞系可能直接死亡。

传代过晚（汇合度 100% 或多层堆积）：细胞触发接触抑制，进入 G0 停滞期；细胞代谢废物堆积，形态发生变异；消化难度剧增，需强力消化导致损伤；诱发细胞分化、基因突变或加速老化。

四、传代前的准备（成功的基础）

4.1 环境准备

生物安全柜 / 超净工作台：提前 20–30 分钟开启紫外灯照射灭菌。

风机平衡：关闭紫外灯，开启风机与照明，让洁净气流自净 5–10 分钟。

表面消毒：使用 75% 医用乙醇无盲区喷洒擦拭工作台面及进出的物品表面。

4.2 试剂准备

基础培养基与完全培养基：提前置于 37 ℃ 水浴锅中预热（注意：减少反复预热次数以防生长因子降解）。

无钙镁 PBS（D-PBS, Ca²⁺/Mg²⁺-free）：钙镁离子会抑制胰酶活性，并增强细胞间粘附，因此洗涤液必须无钙镁。

消化液（Trypsin-EDTA）：常规浓度 0.25% Trypsin + 0.02% EDTA；敏感/易消化细胞用 0.05% Trypsin + 0.02% EDTA 或非酶消化液。

终止液：含 10% 胎牛血清（FBS）的完全培养基（血清中的 α₁-抗胰蛋白酶能有效中和胰酶活性）。

4.3 器材准备

移液枪及无菌枪头（10 μL、200 μL、1000 μL）；无菌电动移液管（5 mL、10 mL、25 mL）；无菌离心管（15 mL / 50 mL）、培养瓶（T25 / T75）或培养皿；倒置显微镜、血球计数板或自动细胞计数仪。

4.4 细胞状态检查（“一看二闻三对比”）

在开始操作前，必须在倒置显微镜下全面检查细胞：

形态观察：贴壁细胞形态是否清晰、饱满？是否有大量异常泡化、变圆或浮起？

密度评估：全视野评估汇合度是否达到传代要求。

污染排查：细菌——培养基浑浊，镜下可见大量高速游动的细小颗粒；真菌——可见丝状菌丝或白色念珠菌呈串珠状；支原体——液体不浑浊，但细胞生长缓慢、状态差、碎片多（需通过 PCR 或荧光染色确诊）。

五、标准操作流程（实操篇，核心章节）

5.1 贴壁细胞消化传代法（胰酶/EDTA 法）

以下以 T25 培养瓶为例，说明详尽步骤：

1. 弃液：从 incubator 取出 T25 培养瓶，吸弃瓶内旧的废弃培养基。

2. 清洗（重点）：向瓶内加入 3–5 mL 预热的无钙镁 PBS，极其轻柔地晃动培养瓶洗涤 1–2 次，吸弃 PBS。目的是彻底清除残留培养基中的血清（血清会严重抑制胰酶活性）及细胞碎片。

3. 加消化液：加入 1.0 mL 0.25% Trypsin-EDTA 消化液，平放培养瓶，使其均匀覆盖细胞单层。

4. 孵育与观察：将培养瓶置于 37 ℃ 温箱或室温下孵育 1–3 分钟。每隔 30 秒至 1 分钟置于倒置显微镜下观察。当看到细胞质收缩、胞体变圆、细胞间隙增大，轻敲瓶壁有部分细胞成片滑落时，立即停止孵育。

5. 终止消化：立即向瓶内加入 2–3 mL 含血清的完全培养基，终止胰酶消化。

6. 吹打分散：用移液管吸取终溶液，吸嘴对准贴壁细胞区域，轻柔、均匀地上下吹打 5–8 次，使细胞完全脱落并分散成单细胞悬液。注意：避免产生大量气泡（气泡剪切力会导致细胞膜破裂）。

7. 离心收集：将细胞悬液转移至 15 mL 无菌离心管中。配平后，室温离心 1000～1200 rpm（约 200～300×g），离心 3–5 分钟。

8. 重悬与计数：小心吸弃离心上清，切勿触及管底的细胞沉淀。加入 1–2 mL 新鲜完全培养基，用枪头轻柔吹打沉淀，使其重悬为均匀悬液。吸取 10 μL 进行细胞计数与活率鉴定。

9. 接种分瓶：根据预定的接种密度，向新的 T25 瓶中补足新鲜完全培养基（总体积 5–7 mL）。将适量细胞悬液加入新瓶中，轻晃交叉“十”字混匀，并在瓶身做好标记，放回 37 ℃、5% CO₂ 培养箱。

5.2 悬浮细胞传代法

悬浮细胞不贴壁，传代逻辑更为直接，主要有两种操作方式：

方式 A：半换液/直接稀释法（适用于生长状态良好、无大量废物的细胞）

1. 观察细胞密度，若密度达到 1×10⁶ cells/mL。

2. 彻底吹打混匀原培养瓶中的细胞悬液。

3. 根据传代比例（如 1:3），直接吸出 2/3 的细胞悬液废弃或用于实验。

4. 向原瓶中补足 2/3 体积的新鲜预热完全培养基，混匀后继续培养。

方式 B：全离心换液法（适用于细胞密度过高、培养基严重变黄或碎片较多时）

1. 将原瓶中的细胞悬液全部转移至离心管中。

2. 1000 rpm 离心 5 分钟，弃去含代谢废物的上清液。

3. 加入新鲜完全培养基重悬细胞沉淀。

4. 计数后按指定接种密度分装至新的培养瓶中。

5.3 其他特殊传代方式

1. 机械刮取法（Mechanical Scraping）：适用于对胰酶高度敏感且贴壁极牢固的细胞（如巨噬细胞 RAW264.7）；或用于保持细胞表面受体结构完整的实验。操作要点：吸弃旧液，加入少量 PBS 或新培养基，使用无菌细胞刮刀（Cell Scraper）沿着一个方向单向平稳刮下细胞，吹打重悬。缺点：机械损伤相对较大，细胞存活率略低于酶消化法。

2. 非酶消化法（Non-enzymatic Dissociation）：适用于流式细胞术（FACS）检测细胞表面标记物，或干细胞培养。常用试剂：基于 EDTA 螯合作用的 Cell Dissociation Buffer 或 TrypLE（重组抗蛋白酶试剂）。优点：不破坏细胞膜表面蛋白受体结构。

六、传代比例与接种密度

传代不能仅凭“感觉”，必须定量化，以确保细胞生长的稳定周期。

6.1 常用传代比例的选择

1:2 — 适用于原代细胞、生长缓慢的细胞、受损恢复期细胞。

1:3 – 1:5 — 适用于绝大多数标准有限细胞系（如 NIH3T3, MCF-7）。

1:6 – 1:10 — 适用于增殖极快的转化细胞系/肿瘤细胞（如 HEK293T）。

6.2 推荐接种密度（Seeding Density）

对于定量实验，推荐按照培养面积（cells/cm²）计算接种量。常规贴壁细胞推荐接种密度：1×10⁴～3×10⁴ cells/cm²。

常用培养容器参数对照表

6.3 细胞计数方法

方法一：传统血球计数板法（Hemocytometer）

1. 样品准备：取 10 μL 细胞悬液与 10 μL 0.4% 台盼蓝（Trypan Blue）染液混合（1:1 稀释）。

2. 加样：取 10 μL 混合液注入计数板盖玻片边缘，利用毛细现象充满计数室。

3. 计数：在显微镜下对 4 个大方格（大方格体积为 0.1 mm³ = 10⁻⁴ mL）内的活细胞（不着色）进行计数，死细胞呈蓝色。

4. 计算公式：细胞浓度（cells/mL）= 4 个大方格活细胞总数 / 4 × 稀释倍数(2) × 10⁴；细胞存活率（%）= 活细胞数 /（活细胞数 + 死细胞数）× 100%。

方法二：自动细胞计数仪法

利用芯片计数板，只需吸取 10 μL 样品插入仪器，基于图像识别或台盼蓝荧光染色，几秒内即可自动输出细胞浓度、平均直径及存活率，能大幅减少人为计数误差。

七、传代过程中的常见问题与对策

在实际操作中，新手常面临消化不良、污染或生长停滞等问题。以下为临床及科研实验室常见的 Troubleshooting 汇总：

传代常见问题与对策对照表

八、质量控制与记录（专业进阶）

规范的实验室管理要求将细胞培养纳入严格的质控（QC）体系。

8.1 传代次数（Passage Number, P 值）管理

定义：细胞从原代培养（P0）或复苏后每次经过消化拆分传代，P 值加 1（即 P1, P2, P3...）。

风险：随着传代次数增加（通常无限细胞系超过 P20～P30，原代细胞超过 P5～P10），细胞会出现遗传漂变（Genetic Drift）、染色体非整倍体化、表型改变以及受体表达下降。

管理原则：实验应尽量使用低代次细胞（如 P5～P15 内）；建立“主种子库（Master Seed Bank）”与“工作种子库（Working Seed Bank）”二级冻存管理体系。

8.2 支原体（Mycoplasma）常规筛查

支原体大小介于细菌与病毒之间（0.1–0.3 μm），能穿过常规 0.22 μm 滤膜，且不引起培养基浑浊。

筛查频率：建议每 1–3 个月对培养中的细胞进行一次常规筛查。

筛查方法：PCR 扩增法（最灵敏）、Hoechst 33258 荧光染色法、ELISA 显色法。

Hoechst 33258 染色判读：正常细胞仅胞核发强荧光、胞质干净；支原体污染细胞在胞核周围及胞质存在大量细小荧光斑点。

8.3 细胞交叉污染与 STR 鉴定

在细胞培养历史上，HeLa 细胞等强力肿瘤细胞系污染其他细胞系（如将 HTA-8 错误鉴定为上皮细胞，实际已被 HeLa 替代）的事件屡见不鲜。

STR 鉴定（Short Tandem Repeat Profiling）：对于人类细胞系，是目前国际公认的身份鉴定“指纹”标准。

要求：在发表高水平论文、建立新 cell line 或课题开题前，应将细胞送往第三方机构进行 STR 鉴定，比对 ATCC/DSMZ 数据库。

8.4 规范化细胞日志（Cell Culture Log）

每次传代均应在培养瓶及实验室日志上记录以下 6 项基本要素：

细胞名称（Cell Line）；当前代次（Passage No.）；传代日期（Date）；传代比例 / 密度（Ratio/Density）；培养基批号（Media Lot）；操作人（Operator）。

示例：细胞名称 HEK293T；当前代次 P12；传代日期 2023-10-25；传代比例 / 密度 1:4 (3.5 × 10⁵ cells/mL)；培养基批号 DMEM + 10% FBS (Lot#20230901)；操作人 张科研。

九、结语

细胞传代看似是一项机械重复的实验基本功，但其背后蕴含着严谨的细胞生物学规律。

操作者的无菌意识决定了细胞的安危，观察敏锐度决定了传代的最佳时机，而轻柔规范的手势则决定了细胞的存活与稳定。唯有重视每一个洗涤、消化、离心与吹打的细节，做到“心细、手稳、观察勤”，才能保障细胞始终处于最佳的生理状态，为下游各项实验提供真实、可靠、可重复的数据基石。