一、产品物理化学特征与人源种属选择性

1.1 hSCF的分子结构与二聚化特征

重组人干细胞因子（hSCF）可溶性结构域由165个氨基酸组成，其物理化学结构特征如下：

· 短四螺旋束与非共价二聚体：单体呈典型的四螺旋束（4-Helix Bundle）折叠，胞内包含2对保守的二硫键（Cys4-Cys89和Cys43-Cys138）。在生理水溶液中，两个单体通过疏水相互作用自组装形成非共价同源二聚体（Homodimer，~36–38 kDa）。只有二聚体形式才能交联两个人c-Kit受体分子并引发胞内激酶活化。

· 表达系统与糖基化：大肠杆菌表达（非糖基化）：分子量约为18.5 kDa（单体）。研究证实，N-糖基化并不直接参与hSCF与人c-Kit结合界面，因此非糖基化的重组hSCF在体外能够展现与天然蛋白完全相同的生物学比活力；真核表达（糖基化）：分子量分布在30–35 kDa（单体），体内半衰期更长。

1.2 关键技术限制：人源与鼠源SCF的种属特异性差异

科研人员在开展造血干细胞与干细胞分化实验时，必须严格区分人源与鼠源SCF的种属交叉活性：

细胞因子类型	对人c-Kit（Human CD117）的作用	对小鼠/大鼠c-Kit（Rodent CD117）的作用	常见应用场景
人源SCF (hSCF)	强激活（完全结合人c-Kit）	极弱激活（对鼠c-Kit活性下降~800倍）	仅限人源细胞（人CD34+ HSPCs、hiPSCs分化）
鼠源SCF (mSCF/rSCF)	强激活（可结合人c-Kit）	强激活（完全结合鼠源c-Kit）	鼠源细胞及人源细胞均可使用

 

· 技术警示：严禁使用人源SCF（hSCF）去扩增小鼠/大鼠骨髓造血干细胞，由于人hSCF结合小鼠c-Kit Ig3结构域的物理空间阻碍，会导致鼠源干细胞因缺乏c-Kit信号而大量发生凋亡！

在重组细胞因子的质量放行与效价控制规范中，如苏州丰度生物有限公司在其蛋白质量分析体系中，采用人类红白血病细胞系（TF-1）促增殖法对重组hSCF进行批次活性校验，将其半最大效应浓度（ED₅₀）严格控制在1.0–5.0 ng/mL（即比活力 ≥ 2×10⁵ U/mg），同时结合非变性电泳（Native-PAGE）及SEC-MALS确保二聚体纯度 > 90%，SDS-PAGE纯度 ≥ 95%，内毒素 < 0.01 EU/μg，为此类造血核心因子的体外规范应用提供了可靠的技术试剂。

二、作用机制与c-Kit受体二聚化转导原理

2.1 人c-Kit（CD117）受体激活与下游信号网络

人c-Kit是一种III型受体酪氨酸激酶（RTK），其活化过程如下：

hSCF 同源二聚体
        ↓
同时结合两个人 c-Kit 胞外 D1–D3 结构域
        ↓
D4–D5 结构域构象重排 → c-Kit 二聚化
        ↓
胞内交叉自磷酸化
        ↓
┌─────────────────────────────────┐
│ p-Tyr721 → 招募 PI3K p85 亚基   │
│ → Akt-mTOR 促生存通路           │
│ → Bad 磷酸化 / Caspase-3 抑制   │
│ → 维持人 CD34+ 细胞存活         │
├─────────────────────────────────┤
│ p-Tyr568 / p-Tyr570             │
│ → 招募 Src族激酶 + Shc          │
│ → Ras-RAF-MEK-ERK1/2 通路       │
│ → Cyclin D1/D2 转录             │
│ → 人造血前体细胞有丝分裂        │
├─────────────────────────────────┤
│ JAK-STAT3/5 通路                │
│ → 与 SALL4/HOXB4 转录因子协同   │
│ → 维持造血干细胞未分化干性      │
└─────────────────────────────────┘

2.2 TF-1细胞促增殖效价测定原理

体外定量评价hSCF生物学比活力的经典方法是基于人源依赖性细胞系的促增殖比色法：

· TF-1细胞系：来源于人类红白血病，细胞膜表面高表达人c-Kit受体。当培养体系中除去GM-CSF后，细胞的存活与增殖完全依赖于外源加入的hSCF。

· 量效拟合：在0.01–100 ng/mL浓度范围内，hSCF刺激TF-1细胞增殖的程度与hSCF浓度对数呈典型的S型S-curve剂量反应。通过CCK-8或CellTiter-Glo测定细胞相对代谢活性，拟合计算ED₅₀值。

三、实验准备工作、试剂与耗材

为构建高倍数扩增且不发生非特异性分化的人造血干细胞体外培养体系，需准备以下无菌、无内毒素的器材与试剂：

3.1 实验仪器与设备

· 二氧化碳培养箱（设定为37°C, 5% CO₂或5% O₂低氧环境）。

· 流式细胞仪（具备人CD34、CD117、CD45标记荧光检测通道）。

· 多功能荧光/吸收光酶标仪（具有450 nm / 化学发光检测功能）。

· 生物安全柜（II级A2型）。

3.2 耗材与试剂清单

类别	名称	规格 / 纯度与实验用途
重组蛋白	重组人SCF（hSCF，二聚体）	高纯度（≥95%），无内毒素级（冻干粉），人CD34+干细胞扩增/hiPSC分化
协同因子	重组人TPO、FLT3-L、IL-3、IL-6	高纯度（≥95%），无内毒素级，人造血干细胞Cocktail协同因子
小分子化合物	SR1（StemRegenin 1）或UM171	纯度 > 98%，干细胞级，抑制人造血干细胞体外分化
指示细胞	TF-1细胞 或 人脐带血CD34+ HSPCs	无支原体污染，纯度 > 90%，活性测定/人原代干细胞扩增
基础培养基	StemSpan SFEM II 或 X-VIVO 15	无血清人造血干细胞扩增级，无血清造血干细胞扩增培养基
检测试剂	CCK-8显色试剂盒 / 抗体（Anti-Human CD34-PE）	分析纯 / 流式验证级，促增殖测定 / 流式纯度鉴定
载体蛋白	0.1%重组人血清白蛋白（rHSA）或精制BSA	超纯无内毒素，无脂肪酸，复溶及防止管壁非特异吸附
实验耗材	96孔平底板 / 24孔超低吸附板（Low-Attach）	TC处理级 / 超低蛋白吸附，细胞增殖 / 人原代干细胞悬浮扩增

 

四、标准化体外细胞增殖效价与人CD34+细胞扩增操作流程

本流程包含“hSCF冻干粉复溶保存”、“基于TF-1细胞的hSCF活性测定”与“人脐带血CD34+ HSPCs体外无血清扩增流程”。

4.1 hSCF重组蛋白的复溶与保存规范

· 开瓶前瞬时离心：收到hSCF冻干粉后，于10,000 ×g离心1分钟，使粉末沉降至管底。

· 配制复溶缓冲液：使用无菌DPBS（pH 7.4），并添加0.1%重组人血清白蛋白（rHSA）或0.1%超纯BSA。

· 复溶：吸取缓冲液加入hSCF管中，配制成0.1 mg/mL（100 μg/mL）的母液。室温静置10分钟使其彻底溶解，轻柔颠倒混匀。严禁剧烈漩涡振荡。

· 分装与储存：根据单次用量（如10 μL/管）分装于无菌低吸附管中，置于-80°C超低温保存。

4.2 基于TF-1细胞的hSCF活性测定流程

· TF-1细胞饥饿处理（因子撤退）：取对数生长期的TF-1细胞，用无因子RPMI-1640洗涤细胞3次，洗去残余GM-CSF。用含1% FBS的RPMI-1640重悬，于37°C培养箱中饥饿培养16–24小时。

· 梯度稀释hSCF：用含10% FBS的RPMI-1640培养基将hSCF母液稀释至最高浓度（如100 ng/mL）；进行3倍倍比稀释，设置10个浓度梯度（范围0.001–100 ng/mL），每个浓度设3个复孔。

· 接种与培养：调整饥饿后的TF-1细胞密度至1.0×10⁵ cells/mL。向96孔板每孔中加入50 μL细胞悬液（即5,000 cells/孔），同时加入50 μL梯度稀释的hSCF溶液（反应总体积100 μL）。

· 对照设置：阴性对照孔（不加hSCF）；空白对照孔（仅加培养基）。置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育48–72小时。

· 显色与拟合：每孔加入10 μL CCK-8显色液，孵育2–4小时后测定450 nm处吸光度，拟合4PL曲线计算ED₅₀。

4.3 人脐带血CD34+ HSPCs体外无血清扩增流程

· 原代CD34+细胞准备：复苏或通过磁珠阳性选择法纯化获得人脐带血CD34+细胞（纯度应 > 90%）。

· 配制无血清扩增Cocktail培养基：基础培养基：StemSpan SFEM II或X-VIVO 15；核心因子组合：重组人SCF（100 ng/mL）+ 重组人TPO（50 ng/mL）+ 重组人FLT3-L（100 ng/mL）+ 重组人IL-6（20 ng/mL）；小分子添加（可选）：可选择性加入1 μM SR1或35 nM UM171，以进一步抑制CD34+细胞的体外自发分化。

· 扩增培养：将CD34+细胞以1.0×10⁵ cells/mL接种于24孔超低吸附板中，置于37°C、5% CO₂（推荐5% O₂低氧）培养箱中培养7–12天，每2–3天半量补加新鲜Cocktail培养基。流式检测CD34+/CD45+表型率与细胞扩增倍数（表观扩增通常可达50–200倍）。

五、全流程注意事项与技术风险控制

在进行hSCF实验及人造血干细胞/hiPSC造血分化培养时，需重点防控以下技术风险：

5.1 单一因子与协同因子（Cocktail）的合理配比

· 扩增陷阱：在人原代CD34+造血干细胞扩增中，若仅单独添加hSCF，hSCF仅能维持细胞存活，无法实现高倍数的干细胞自我更新扩增。

· 规范：要实现人CD34+干细胞的高效扩增，必须使用“hSCF (100 ng/mL) + hTPO (50 ng/mL) + hFLT3-L (100 ng/mL)”三因子或四因子（加IL-6）Cocktail。

5.2 非共价同源二聚体的热与物理保护

· 构象保护：活性hSCF是由两条单体靠疏水作用组装成的非共价二聚体。

· 变性风险：剧烈漩涡振荡、反复冻融（> 2次）或高于40°C的环境会导致非共价二聚体解离为无活性的单体。复溶后必须温和颠倒混匀，分装于-80°C保存。

5.3 载体蛋白（rHSA/BSA）防吸附规范

· 吸附机制：hSCF在微克/纳克级（ng/mL）稀释液中，极易吸附于普通聚丙烯离心管及枪头内壁。

· 规范：复溶母液及稀释缓冲液中必须保持0.1%重组人血清白蛋白（rHSA）或BSA的存在；人源临床前细胞培养推荐全线使用无异源成分的rHSA；所有稀释步骤必须使用低吸附（Low-binding）耗材。

5.4 严格控制内毒素（LPS）污染

· 内毒素干预：人CD34+造血干细胞及hiPSCs表面的TLR4对内毒素极度敏感。微量内毒素（> 0.05 EU/mL）会诱导干细胞爆发炎症因子，导致干细胞提前发生耗竭性分化或凋亡。

· 对策：确保所用重组hSCF蛋白内毒素 < 0.01 EU/μg。

在重组细胞因子的长期稳定性控制方面，如苏州丰度生物研发团队的技术测试数据所示，分装于含0.1% rHSA的DPBS中的重组人hSCF蛋白，储存于-80°C超低温冰箱历经12个月，其通过TF-1促增殖法测得的ED₅₀变异率小于5%，保证了其在人原代造血干细胞长期扩增与hiPSC造血分化实验中的效价一致性。

六、常见问题排查与解决方案（Troubleshooting）

异常现象	潜在原因诊断	排查与改进措施
人脐带血CD34+细胞在培养3天内未见扩增，且发生大量凋亡	A. 体系中仅使用了单一hSCF，未构建TPO/FLT3-L协同Cocktail B. 培养基中hSCF浓度不足（低于50 ng/mL） C. 重组hSCF蛋白内毒素超标	1. 补齐“hSCF (100 ng/mL) + hTPO (50 ng/mL) + hFLT3-L (100 ng/mL)”Cocktail 2. 确保hSCF终浓度达到100 ng/mL 3. 更换内毒素 < 0.01 EU/μg的高纯hSCF
人CD34+细胞虽有数量扩增，但流式检测发现CD34+比例骤降（< 20%，发生早期分化）	A. 使用了普通TC处理贴壁培养板，诱导了干细胞贴壁分化 B. 培养体系中未加入小分子抑制剂（如SR1或UM171） C. 换液不及时，细胞密度过高（> 1×10⁶ cells/mL）	1. 必须使用超低吸附（Ultra-Low Attachment）培养板进行悬浮扩增 2. 在Cocktail中加入1 μM SR1或35 nM UM171抑制分化 3. 及时按1:2或1:3稀释传代，保持细胞密度在2–8×10⁵ cells/mL
TF-1细胞促增殖测试中，吸光度曲线平缓，ED₅₀ > 20 ng/mL	A. hSCF母液经历多次反复冻融，非共价二聚体解离失活 B. 复溶时未加入0.1% rHSA/BSA，导致管壁严重吸附 C. TF-1细胞未进行充分的GM-CSF撤退饥饿处理	1. 使用新鲜解冻且未反复冻融的hSCF分装液 2. 复溶缓冲液中必须补充0.1% rHSA/BSA 3. 增加TF-1细胞洗涤次数，确保无因子饥饿满16–24小时

 

七、总结与科研展望

人干细胞因子（hSCF/Kit Ligand）作为驱动人源c-Kit受体二聚化及下游PI3K-Akt/Ras-MAPK信号级联活化的核心细胞因子，在人脐带血/动员外周血CD34+造血干细胞体外扩增、hiPSC诱导造血（如CAR-NK/CAR-T细胞前体诱导）及人肥大细胞发育研究中占据着举足轻重的地位。体外应用hSCF的技术实施关键，在于深刻理解其人源种属特异性限制（严禁用于鼠源细胞），建立起“hSCF (100 ng/mL) + hTPO + hFLT3-L”无血清Cocktail扩增规范、0.1%载体蛋白（rHSA）防吸附体系以及非共价二聚体的物理防变性保护。