一、分子特性与产品描述

干细胞因子（Stem Cell Factor, SCF，又称 c-Kit Ligand/KL、Mast Cell Growth Factor/MGF、Steel Factor）是造血微环境（Niche）中骨髓基质细胞及内皮细胞分泌的关键细胞因子。

1.1 二聚体分子结构与受体交叉结合特性

成熟的人 SCF 膜外可溶性片段由 165 个氨基酸残基组成，单体分子量约为 18.4 kDa：

· 非共价二聚体拓扑构象：溶液中的 rhSCF 主要通过疏水相互作用形成非共价结合的同源二聚体（分子量约为 36 kDa）。每个单体包含由 4 个反平行 α-螺旋（Helices A–D）组成的包拢折叠结构，并由 2 对分子内二硫键（Cys4−Cys89 和 Cys43−Cys138）进行共价稳定。

· 受体 c-Kit（CD117）结合机制：rhSCF 二聚体的两个对称活性位点可同时识别并交叉结合 2 个 c-Kit 受体单体的胞外 D1–D3 结构域。只有二聚体形态的 rhSCF 才能有效地拉近 2 个 c-Kit 单体，引发受体同源二聚化及胞内激酶结构域的活化。

1.2 苏州丰度生物 rhSCF 的质量质控标准

苏州丰度生物科技有限公司依托高效的重组发酵表达与多级层析纯化平台，生产的重组人干细胞因子（rhSCF）具备以下高度严谨的质量规格：

· 分子纯度与二聚体比例：经 SDS-PAGE 及高效体积排阻色谱（SEC-HPLC）分析，纯度 ≥ 98%，活性同源二聚体比例 > 95%。

· 生物学活性（ED₅₀）：采用促人巨核细胞白血病细胞系 M-07e 或 TF-1 细胞增殖法测定，ED₅₀ ≤ 2.0 ng/mL（具体批次比活在 5×10⁵ U/mg 以上）。

· 超低内毒素控制（造血干细胞级）：采用鲎试剂（LAL）法检测，内毒素控制在 < 0.05 EU/μg，彻底消除内毒素对造血干细胞 TLR4 受体的炎性刺激。

· 批间高度一致性：无宿主 DNA 残留（< 10 pg/μg）及宿主蛋白残留（< 0.005%）。

二、实验原理与 c-Kit 信号转导网络

rhSCF 在驱动造血干/祖细胞（HSPCs）自我更新、维持长期造血重建潜能（LT-HSC）及促肥大细胞增殖中的分子机制如下：

2.1 c-Kit 受体二聚化与多位点自磷酸化

二聚体 rhSCF 结合 c-Kit 胞外结构域后，诱导 c-Kit 发生同源二聚化。受体二聚化促使胞内激酶结构域发生构象改变与自磷酸化，形成包含 Tyr568、Tyr570、Tyr721、Tyr823 和 Tyr936 的胞内多底物锚定残基。

2.2 核心下游信号转导通路

· p85-PI3K-Akt 通路（主存活与自更新通路）：磷酸化的 Tyr721 招募 PI3K 的 p85 亚基，激活 Akt。Akt 执行三重关键保护：

· 磷酸化失活促凋亡蛋白 Bad 与 FOXO3a，维持抗凋亡蛋白 Bcl-2 和 Mcl-1 的高水平表达。

· 激活 mTORC1，调控干细胞蛋白质合成与能量代谢平衡。

· 阻止造血干细胞在体外无血清应激下发生早熟分化，维持 CD34⁺CD38⁻CD45RA⁻CD90⁺ 长期造血干细胞（LT-HSCs）的干性特性。

· Grb2-SOS-Ras-MAPK 通路（促分裂通路）：磷酸化的 Tyr703/Tyr936 招募 Grb2/SOS 复合物，激活 Ras-Raf-MEK-ERK1/2 级联反应，推动 CD34⁺ 前体细胞进入 S 期，进行有丝分裂。

· JAK-STAT 与 Src 激酶通路：调控细胞骨架重排与粘附分子表达，维持造血干细胞的归巢（Homing）与骨髓微环境锚定能力。

2.3 与 TPO、Flt3-L 在造血干细胞扩增中的协同效应

在体外造血干细胞扩增体系中，单独使用 rhSCF 仅能维持细胞存活，无法实现对称性扩增。rhSCF（50–100 ng/mL）必须与血小板生成素（rhTPO，20–50 ng/mL）及 Flt3 配体（rhFlt3-L，50–100 ng/mL）构建三因子联合体系（SCF+TPO+Flt3-L）。

TPO 激活 Mpl-STAT5，Flt3-L 激活 Flt3-Akt，三者信号交叉重叠，可实现脐带血或骨髓 CD34⁺ 细胞在体外数百倍的爆发性扩增，同时保留其免疫缺陷小鼠（NSG）体内长期重建能力。

三、实验前期准备与试剂耗材匹配

由于造血干/祖细胞对环境内毒素、微量蛋白吸附及气溶胶极度敏感，实验前须按照以下规范准备试剂与耗材：

3.1 实验试剂准备

· 重组人干细胞因子（rhSCF）：冻干粉。

· 重构溶剂：无菌无钙镁 PBS（pH 7.4）。

· 保护性载体蛋白：0.1% 重组人血白蛋白（HSA）或 0.1% 无内毒素牛血清白蛋白（BSA）。关键作用：占据管壁吸附位点，防止微量蛋白损耗。

· 协同造血因子：重组人血小板生成素（rhTPO）、重组人 Flt3 配体（rhFlt3-L）、重组人白介素-3（rhIL-3）。

· 造血干细胞无血清培养基：StemSpan SFEM II、CellGro 或 X-VIVO 15。

3.2 实验耗材选型（苏州丰度生物推荐配置）

· 苏州丰度生物低吸附微量离心管（1.5 mL）：采用高疏水性 PP 材质，极大减少二聚体蛋白吸附损耗。

· 苏州丰度生物无菌带滤芯移液吸头（10 μL、200 μL、1000 μL）：防气溶胶交叉污染。

· 苏州丰度生物 0.22 μm PES 针头式滤器：低蛋白结合率滤膜。

· 苏州丰度生物低贴壁/组织培养板（6 孔板/24 孔板）：确保悬浮的 CD34⁺ 细胞不发生非特异性贴壁分化。

四、实验步骤与 CD34⁺ 造血干细胞体外扩增 SOP

步骤 1：离心沉降（重构前必备步骤）

收到 rhSCF 冻干粉试剂后，管盖或管壁可能附着微量粉末。开盖前须将离心管放入微型离心机中，以 10,000 × g 离心 30–60 秒，使冻干粉完全聚集至管底。

步骤 2：储存母液（Stock Solution）配制

· 在无菌超净工作台中，吸取适量含 0.1% HSA（或 BSA）的无菌 PBS（pH 7.4）。

· 向离心管中加入溶剂，配制成浓度为 100 μg/mL 的储存母液（例如：10 μg 冻干粉加入 100 μL 含保护蛋白的重构液）。

· 用移液器缓慢吹打 5–10 次，直至冻干粉完全溶解。严禁剧烈涡旋或高速振荡，防止破坏二聚体非共价交联与三级结构。

步骤 3：母液分装与冻存

将配制好的 rhSCF 母液按单次实验用量（如 10–20 μL/管）分装至苏州丰度生物低吸附离心管中。

贴好标签，立即放入 -80℃ 冰箱中长期保存（可稳定保存 12 个月）或 -20℃ 保存 6 个月。严禁反复冻融。

步骤 4：CD34⁺ 造血干细胞扩增加样流程

· CD34⁺ 细胞富集：从脐带血或骨髓单核细胞中，通过 CD34 磁珠阴性/阳性分选法富集 CD34⁺ 细胞，调整细胞密度为 1–2×10⁵ cells/mL 接种于低贴壁培养板中。

· 三因子扩增体系构建（Day 0）：向无血清培养基中加入 rhSCF（终浓度 100 ng/mL）、rhTPO（终浓度 50 ng/mL）及 rhFlt3-L（终浓度 100 ng/mL），混匀后加入培养板，于 37℃、5% CO₂ 培养箱中培养。

· 补液与扩增监控（Day 3-7）：每 3 天补充半量含有相同浓度三因子的新鲜无血清培养基，保持细胞密度在 1×10⁶ cells/mL 以下。

· 干性与集落形成（CFC）鉴定：扩增 7–14 天后，通过流式细胞术测定 CD34⁺CD38⁻ 表达率，并在半固体甲基纤维素培养基中接种进行造血集落形成实验（CFU-GEMM、CFU-GM、BFU-E），评估扩增细胞的多潜能造血重建能力。

五、全过程注意事项与技术质控节点

· 三因子协同的不可替代性：在 CD34⁺ 造血干细胞无血清扩增体系中，单独使用 rhSCF 仅能维持细胞存活，无法诱导干细胞的对称性扩增。必须与 rhTPO 和 rhFlt3-L 联合使用，才能形成协同信号网，实现造血干细胞数量的真实扩增。

· 内毒素（LPS）污染的绝对控制：CD34⁺ 造血干/祖细胞表达 TLR4 受体。若体系中内毒素浓度 > 0.1 EU/mL，内毒素会激活 NF-κB 通路，诱导 CD34⁺ 细胞快速发生早熟的髓系分化（耗竭干性）。配制与培养全过程须使用苏州丰度生物低内毒素耗材与试剂。

· 保护性载体蛋白（BSA/HSA）防护：rhSCF 单体分子量约 18.4 kDa，在微量稀释（< 10 μg/mL）下极易吸附于离心管或吸头内壁。重构母液时须强制添加 0.1% BSA/HSA，否则会导致实际可用蛋白浓度下降 50% 以上。

· 非共价二聚体剪切防护：rhSCF 的生物活性依赖于非共价结合的同源二聚体结构。溶解吹打时移液器吸头应保持浸入液面下，轻轻吸吐，禁止剧烈震荡产生大量泡沫，防止二聚体发生解聚失活。

· 严禁反复冻融：反复冻融产生的冰晶剪切力会导致 rhSCF 的空间二聚体构象破坏。分装规格须严格按照单次实验用量设定，解冻后的母液若未用完，可在 4℃ 避光保存并在 2 周内用完，切勿重新入库 -80℃ 冻存。

六、总结

重组人干细胞因子（rhSCF）作为造血干细胞微环境中的核心“锚定因子”，其非共价二聚体结构的完整性与高生物活性是 CD34⁺ 造血干/祖细胞体外无血清扩增、维持长期造血重建潜能以及肥大细胞分化的根本保障。

通过规范的离心重构、保护性载体蛋白添加、三因子协同加样及严谨的分装冻存，能够显著提升造血干细胞体外扩增效率与实验可重复性。

苏州丰度生物科技有限公司将持续聚焦高质量干细胞与造血细胞因子及配套试剂的技术创新，为造血干细胞研究、基因治疗及再生医学提供高标准的技术支撑。