一、分子特性与产品描述
白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）最初因其能够诱导小鼠骨髓性白血病细胞（M1 细胞）发生终末分化并抑制其增殖而被发现。后续研究表明，LIF 是一种高度多效性的糖蛋白，在干细胞自我更新、着床前胚胎发育、神经胶质分化及造血调控中发挥关键作用。
1.1 分子结构与二硫键构象稳定性
成熟的人 LIF 蛋白质由 180 个氨基酸残基组成。在大肠杆菌重组表达系统生产的无糖基化重组人白血病抑制因子（rhLIF）分子量约为 19.7 kDa：
· 核心三维构象：rhLIF 包含一个由 4 个反平行 α-螺旋（Helices A–D）构成的核心包拢折叠结构。
· 分子内二硫键：分子内部包含 3 对共价交联的二硫键（Cys12−Cys134、Cys18−Cys131 和 Cys60−Cys163）。这 3 对二硫键对于维持 rhLIF 的空间构象及与受体结构域的准确结合至关重要。
1.2 跨种属生物学活性特点
人 LIF 与小鼠 LIF 在氨基酸序列上具有约 78% 的同源性。重组人 LIF（rhLIF）可交叉激活小鼠细胞表面的 LIF 受体，且对小鼠受体的结合亲和力与小鼠本土 mLIF 相当，因此 rhLIF 被广泛用于小鼠胚胎干细胞（mESCs/miPSCs）以及人幼稚态多能干细胞（Naive hPSCs）的无滋养层培养体系中。
1.3 苏州丰度生物 rhLIF 的质量质控标准
苏州丰度生物科技有限公司基于高效重组发酵表达与多级层析纯化技术平台，生产的重组人白血病抑制因子（rhLIF）具备以下高度严谨的质量指标：
· 分子纯度：经 SDS-PAGE 及反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析，纯度 ≥ 98%。
· 生物学活性（ED₅₀）：采用 M1 小鼠白血病细胞分化抑制法或 TF-1 细胞促增殖法测定，ED₅₀ ≤ 0.01 ng/mL（具体比活在 1×10⁸ U/mg 以上，即 1 ng ≈ 100 Units）。
· 超低内毒素控制（干细胞级）：采用鲎试剂（LAL）法检测，内毒素控制在 < 0.05 EU/μg（低于 0.005 EU/1000 U），彻底杜绝内毒素引发的干细胞自发分化与自噬反应。
· 无杂质残留：严格测定分子量与高阶结构，无宿主 DNA 及宿主蛋白残留。
二、实验原理与受体信号转导机制
rhLIF 在维持胚胎干细胞幼稚态（Naive State）多能性及抑制分化中的分子机制如下：
2.1 异二聚体受体复合物的装配
rhLIF 结合细胞膜表面的低亲和力受体亚基 LIFRβ（CD118），结合后诱导构象改变，进而招募高亲和力跨膜信号转导蛋白 gp130（CD130，与 IL-6 家族共享），形成“LIF:LIFRβ:gp130”高亲和力异二聚体信号复合物。
2.2 核心下游信号转导通路
· JAK1-STAT3 通路（多能性维持主通路）：受体异二聚化促使与受体胞内段结合的 JAK1 激酶发生反式自磷酸化，进而磷酸化 gp130 和 LIFR 胞内段的酪氨酸残基。这些磷酸化位点招募胞质中的转录因子 STAT3，使其在 Tyr705 位点发生关键磷酸化。磷酸化的 STAT3（p-STAT3）形成同源二聚体并转运至细胞核内，直接激活多能性核心转录因子 Klf4、Esrrb、Tbx3 及 Nanog 的转录，维持干细胞的原始圆顶状（Domed）克隆形态并阻断向原始内胚层及中胚层分化的途径。
· PI3K-Akt 通路：磷酸化 Akt 抑制 GSK-3β 活性，协同促使 β-catenin 和 Tfe3 进入细胞核，巩固 Naive 态多能性网络。
· SHP2-MAPK/ERK 通路：SHP2 介导的适度 ERK 激活参与调控细胞周期，但在无滋养层干细胞培养中，过度激活的 ERK 会诱导细胞脱离 Naive 态向 Primed 态分化，因此通常需联合使用 MEK 抑制剂（如 PD0325901，即 2i/LIF 体系）。
三、实验前期准备与试剂耗材匹配
由于胚胎干细胞对培养微环境中的内毒素、重金属离子及微量蛋白吸附极度敏感，实验前须按照以下规范准备试剂与耗材：
3.1 实验试剂准备
· 重组人白血病抑制因子（rhLIF）：冻干粉。
· 重构溶剂：无菌无钙镁 PBS（pH 7.4）。
· 保护性载体蛋白：0.1% 重组人血白蛋白（HSA）或 0.1% 无内毒素牛血清白蛋白（BSA）。关键作用：占据容器表面吸附位点，防止微量蛋白损耗。
· 无滋养层培养基：mESC 完全培养基、2i/LIF 培养基（含 PD0325901 和 CHIR99021）或 Naive hPSC 转化培养基。
3.2 实验耗材选型（苏州丰度生物推荐配置）
· 苏州丰度生物低吸附微量离心管（1.5 mL）：采用高疏水性 PP 材质，极大减少多肽在管壁上的物理吸附。
· 苏州丰度生物无菌带滤芯移液吸头（10 μL、200 μL、1000 μL）：阻断气溶胶污染。
· 苏州丰度生物 0.22 μm PES 针头式滤器：低蛋白结合率滤膜。
· 苏州丰度生物组织培养板（6 孔板/12 孔板）：经明胶（Gelatin）或 Laminin-511/Vitronectin 包被，适应干细胞贴壁。
四、实验步骤与干细胞多能性维持 SOP
步骤 1：离心沉降（重构前必备步骤）
收到 rhLIF 冻干粉试剂后，管盖或管壁可能附着微量粉末。开盖前须将离心管放入微型离心机中，以 10,000 × g 离心 30–60 秒，使冻干粉完全聚集至管底。
步骤 2：储存母液（Stock Solution）配制
· 在无菌超净工作台中，吸取适量含 0.1% HSA（或 BSA）的无菌 PBS（pH 7.4）。
· 向离心管中加入溶剂，配制成浓度为 100 μg/mL（约为 1×10⁷ U/mL）的储存母液（例如：10 μg 冻干粉加入 100 μL 含保护蛋白的 PBS）。
· 用移液器缓慢吹打 5–10 次，直至冻干粉完全溶解。严禁剧烈涡旋或高速振荡，防止产生气泡破坏蛋白质二硫键及三级结构。
步骤 3：母液分装与冻存
将配制好的 rhLIF 母液按单次实验用量（如 10–20 μL/管）分装至苏州丰度生物低吸附离心管中。
贴好标签，立即放入 -80℃ 冰箱中长期保存（可稳定保存 12 个月）或 -20℃ 保存 6 个月。严禁反复冻融。
步骤 4：干细胞培养加样流程与多能性鉴定
工作终浓度推荐
· 小鼠胚胎干细胞（mESCs/miPSCs）无滋养层培养：终浓度 10 ng/mL（即 1000 U/mL）。
· 人 Naive 态多能干细胞（Naive hPSCs）诱导与维持：终浓度 10–20 ng/mL（1000–2000 U/mL）。
· 神经干细胞向星形胶质细胞定向诱导：终浓度 10–50 ng/mL。
加样与换液：临用前，将一管母液从 -80℃ 取出置于冰上融化。按 1:10,000 比例稀释至干细胞完全培养基中，充分混匀。培养过程中每 24–48 小时全量更换一次含 rhLIF 的新鲜培养基。
多能性鉴定：经过连续传代培养后，通过碱性磷酸酶（AP）染色观察圆顶状集落呈强阳性，并通过免疫荧光或 RT-qPCR 检测 Oct4、Nanog、Sox2 的高水平表达。
五、全过程注意事项与技术质控节点
· 跨种属活性的正确理解（人源 rhLIF 可用于小鼠细胞）：重组人 LIF（rhLIF）对小鼠受体复合物（LIFRβ/gp130）具备极高的交叉激活活性，其比活力与小鼠 mLIF 相当，因此 rhLIF 可完全替代 mLIF 用于小鼠 ESCs/iPSCs 的培养。然而，小鼠 mLIF 对人受体的结合亲和力显著偏低，不可逆向用于人干细胞培养。
· 内毒素（LPS）污染对多能性的毁灭性破坏：胚胎干细胞对环境内毒素极其敏感。若体系中内毒素浓度 > 0.1 EU/mL，会导致 STAT3 磷酸化水平下降，诱发干细胞边缘平铺、扁平化分化及自噬。配制与培养全过程须使用苏州丰度生物低内毒素耗材与试剂。
· 保护性载体蛋白（BSA/HSA）防护：rhLIF 分子量约 19.7 kDa，在微量稀释下极易吸附于离心管内壁。重构母液时须强制添加 0.1% BSA/HSA，否则会导致实际可用蛋白浓度大幅降低，引致干细胞因 LIF 不足而分化。
· 与 2i（MEK/GSK3 抑制剂）的精准协同：在 Naive 态干细胞培养中，单独使用高浓度 LIF 可能因过度的 ERK 激活而引发分化，因此通常与 MEK 抑制剂（PD0325901，1 μM）及 GSK3 抑制剂（CHIR99021，3 μM）联合使用，构建极高纯度的 Naive 态多能性微环境。
· 吹打溶解气泡控制与严禁反复冻融：多肽在气-液界面张力作用下极易变性与发生共价聚集。溶解吹打时移液器吸头应保持浸入液面下，轻轻吸吐，禁止剧烈震荡产生大量泡沫。冻融产生的冰晶剪切力会导致 rhLIF 的空间构象破坏，分装规格须严格按照单次实验用量设定，解冻后的母液切勿重新入库 -80℃ 冻存。
六、总结
重组人白血病抑制因子（rhLIF）作为维持干细胞 Naive 态多能性与调控细胞命运决定的核心因子，其高生物活性与超低内毒素指标是胚胎干细胞无滋养层自更新、幼稚态转化及神经胶质分化的根本保障。
通过规范的离心重构、保护性载体蛋白添加、跨种属活性的精准应用以及严谨的分装冻存，能够显著提升干细胞多能性维持的稳定度与实验重复性。
苏州丰度生物科技有限公司将持续聚焦高质量干细胞关键细胞因子与配套试剂的技术创新，为干细胞生物学、发育生物学及再生医学领域提供高标准的技术支撑。
