一、分子特性与产品描述

肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor, HGF，亦称 Scatter Factor, SF）最初作为强效的成体肝细胞促分裂原与上皮细胞分散因子被发现。天然 HGF 为复杂的高度糖基化异二聚体蛋白，前体蛋白由 728 个氨基酸残基组成，在细胞外经特异性丝氨酸蛋白酶（如 HGF 激活物 HGFA）在 Arg494-Val495 位点发生蛋白酶切，形成活化状态的双链异二聚体。

1.1 异二聚体分子结构与结构域功能

成熟的活性 rhHGF 总分子量约为 80–85 kDa，由 α 链与 β 链通过单一分子间二硫键（Cys487−Cys604）共价连接：

· α 链（约 54–60 kDa）：包含 N-端结构域（PAN/N-domain）及 4 个 Kringle 结构域（K1–K4）。其中 N 结构域与 K1 结构域构成结合受体 c-Met 的高亲和力结合位点，同时 K 结构域具备强肝素（Heparin）结合活性。

· β 链（约 31–34 kDa）：包含一个类似于丝氨酸蛋白酶的结构域（Proline-rich/Serine protease-like domain），虽然缺乏蛋白酶催化三联体活性，但对于结合 c-Met 的低亲和力位点及诱导受体发生构象激活至关重要。

1.2 苏州丰度生物 rhHGF 的质量质控标准

苏州丰度生物科技有限公司基于真核表达系统（CHO/HEK293）及多级精密层析纯化平台，生产的重组人肝细胞生长因子（rhHGF）具备以下高度严谨的质量指标：

· 正确酶切与成熟度：采用真核表达系统确保单链前体（pro-HGF）被完全蛋白酶切转化为活性的双链异二聚体（α/β 链二硫键连接率 > 95%），具备天然糖基化修饰。

· 分子纯度：经还原与非还原 SDS-PAGE 及 SEC-HPLC 分析，纯度 ≥ 95%。

· 生物学活性（ED₅₀）：采用 MDCK 细胞分散实验（Scatter Assay）及 BaF3-c-Met 表达细胞增殖法测定，ED₅₀ ≤ 1.0 ng/mL（具体批次通常 < 0.5 ng/mL），比活大于 1×10⁶ U/mg。

· 超低内毒素控制（细胞级）：采用鲎试剂（LAL）法检测，内毒素控制在 < 0.1 EU/μg，确保对原代肝细胞与干细胞分化体系无毒性干扰。

二、实验原理与 c-Met 信号转导机制

rhHGF 通过结合其专一性高亲和力受体酪氨酸激酶 c-Met（亦称 MET），在调控细胞增殖、迁移、抗凋亡及组织成腔（Tubulogenesis）中的分子机制如下：

2.1 受体二聚化与多底物锚定位点激活

rhHGF 的 α 链高亲和力位点与 β 链低亲和力位点协同结合 2 个 c-Met 受体的胞外 Sema 结构域，形成活性的“2:2”受体复合物。受体二聚化诱导胞内激酶结构域的 Tyr1234/Tyr1235 发生自磷酸化，随后促使 C-端多底物结合位点（Tyr1349/Tyr1356）磷酸化。

2.2 核心下游信号转导通路

· Gab1-Grb2-Ras-MAPK 通路：磷酸化的 Tyr1349/Tyr1356 招募多接头蛋白 Gab1 及 Grb2，激活 Ras-Raf-MEK-ERK1/2 通路。在干细胞向肝谱系分化中，ERK1/2 通路调控核心肝脏转录因子 HNF4α、FOXA2 及 GATA4 的转录，驱动内胚层细胞向肝前体细胞（Hepatoblasts）演进。

· PI3K-Akt 通路：激活的 Akt 抑制 Bad 及 GSK-3β，上调抗凋亡蛋白 Mcl-1，赋予肝细胞强烈的生存信号，防止细胞在组织损伤或传代消化时发生凋亡。

· Rac1/Cdc42 与 STAT3 通路：调控细胞上皮-间质转化（EMT）的可逆调控及细胞骨架重排，使紧密连接的上皮细胞发生解离并迁移（Scatter 现象）；在三维基质胶培养中，STAT3 通路驱动肝前体细胞形成具有功能性胆管管腔的肝/胆类器官（Liver/Cholangiocyte Organoids）。

三、实验前期准备与试剂耗材匹配

由于双链异二聚体糖蛋白（~85 kDa）在低浓度下极易在容器内壁发生非特异性吸附，实验前须按照以下规范准备试剂与耗材：

3.1 实验试剂准备

· 重组人肝细胞生长因子（rhHGF）：冻干粉。

· 重构溶剂：无菌无钙镁 PBS（pH 7.4）。

· 保护性载体蛋白：0.1% 重组人血白蛋白（HSA）或 0.1% 无内毒素牛血清白蛋白（BSA）。关键作用：占据管壁吸附位点，防止微量蛋白损耗。

· 辅助因子：无菌肝素钠（Heparin Sodium，在无血清分化体系中推荐添加终浓度 1–2 μg/mL）。

· 基础培养基：Advanced DMEM/F12、RPMI 1640 或肝类器官专用基础培养基。

3.2 实验耗材选型（苏州丰度生物推荐配置）

· 苏州丰度生物低吸附微量离心管（1.5 mL）：采用高疏水性 PP 材质，极大减少大分子量异二聚体糖蛋白的表面吸附。

· 苏州丰度生物无菌带滤芯移液吸头（10 μL、200 μL、1000 μL）：防气溶胶交叉污染。

· 苏州丰度生物 0.22 μm PES 针头式滤器：低蛋白结合率滤膜。

· 苏州丰度生物低贴壁 24 孔/48 孔培养板：适用于基质胶包埋滴滴培养（Dome culture）。

四、实验步骤与干细胞诱导肝前体细胞/肝类器官 SOP

步骤 1：离心沉降（重构前必备步骤）

收到 rhHGF 冻干粉试剂后，管盖或管壁可能附着微量粉末。开盖前须将离心管放入微型离心机中，以 10,000 × g 离心 30–60 秒，使冻干粉完全聚集至管底。

步骤 2：储存母液（Stock Solution）配制

· 在无菌超净工作台中，吸取适量含 0.1% HSA（或 BSA）的无菌 PBS（pH 7.4）。

· 向离心管中加入溶剂，配制成浓度为 100 μg/mL 的储存母液（例如：10 μg 冻干粉加入 100 μL 含保护蛋白的 PBS）。

· 用移液器缓慢吹打 5–10 次，直至冻干粉完全溶解。严禁剧烈涡旋或高速振荡，防止产生气泡破坏蛋白质 α/β 链间的分子间二硫键及高级结构。

步骤 3：母液分装与冻存

将配制好的 rhHGF 母液按单次实验用量（如 10–20 μL/管）分装至苏州丰度生物低吸附离心管中。

贴好标签，立即放入 -80℃ 冰箱中长期保存（可稳定保存 12 个月）或 -20℃ 保存 6 个月。严禁反复冻融。

步骤 4：多能干细胞（hPSC）向肝前体细胞定向诱导加样流程

· 确定性内胚层（DE）诱导：hPSCs 经过 Activin A 诱导 3 天形成 CXCR4⁺/SOX17⁺ 的确定性内胚层细胞。

· 肝前体细胞（Hepatoblast）规格诱导：切换为含 rhHGF（终浓度 20–50 ng/mL）和 FGF-4（终浓度 10–20 ng/mL）的诱导培养基，连续培养 5–7 天。

· 成熟肝细胞/肝类器官维持：培养过程中每 48 小时半量换液，补充等终浓度的 rhHGF。至第 12–14 天，通过 RT-qPCR 测定 Albumin（白蛋白）、CYP3A4 和 HNF4α 的表达，并通过 PAS 染色验证糖原合成能力；或在基质胶中包埋形成具成腔结构的肝类器官。

五、全过程注意事项与技术质控节点

· 真核表达体系对异二聚体成熟度的重要性：活性 HGF 必须由单链 pro-HGF 经酶切转化为由二硫键连接的 α/β 双链构象。原核表达的非切断单链蛋白活性极低。在实验配制中，须确保所选取的 rhHGF 为具备完全酶切活性的异二聚体形态。

· 载体蛋白（BSA/HSA）防护：rhHGF 总分子量达 80–85 kDa，在微量稀释（< 10 μg/mL）下极易吸附于离心管或吸头内壁。重构母液时必须保证 0.1% BSA/HSA 的存在，否则会导致实际可用蛋白浓度下降 50% 以上。

· 肝素（Heparin）辅助因子的保护机制：在无血清（Serum-Free）培养体系中，建议补充 1–2 μg/mL 肝素钠。肝素结合于 rhHGF 的 α 链 Kringle 结构域，不仅能促进其诱导 c-Met 形成高阶二聚体，还能保护 rhHGF 免受培养基中微量蛋白酶的降解。

· 剪切力与气泡防护：异二聚体蛋白质在气-液界面张力作用下极易变性与发生共价聚集。吹打溶解时移液器吸头应保持浸入液面下，轻轻吸吐，禁止剧烈震荡产生大量泡沫。

· 严禁反复冻融：冻融产生的冰晶剪切力会导致 rhHGF 分子间的二硫键断裂或高级结构破坏。分装规格须严格按照单次实验用量设定，解冻后的母液若未用完，可在 4℃ 避光保存并在 2 周内用完，切勿重新入库 -80℃ 冻存。

六、总结

重组人肝细胞生长因子（rhHGF）作为调控细胞增殖、迁移与组织成腔形态发生的多效性双链异二聚体糖蛋白，其高生物活性与异二聚体成熟度是干细胞向肝谱系定向分化、原代肝细胞维持及肝类器官构建的根本保障。

通过规范的离心重构、保护性载体蛋白添加、肝素辅助协同及严谨的分装冻存，能够显著提升肝前体细胞诱导效率与肝类器官的成腔形态演进。

苏州丰度生物科技有限公司将持续聚焦高品质细胞因子与配套试剂的技术创新，为肝脏再生医学、类器官工程及药物毒理学筛选提供高标准的技术支撑。